革兰氏染色液

革兰氏染色液可用于革兰氏染色法，革兰氏染色法是一种在细菌学中广泛应用的重要鉴别染色方法。 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法。

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：
1）涂片固定。
2）草酸铵结晶紫染1分钟。
3）自来水冲洗。
4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。
5）水洗，用吸水纸吸去水分。
6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。
7）蕃红染色液（稀）染1分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。 1884年丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰（Hans Christian Gram，1853年－1938年）进行了上百次的细菌染色研究后，在一次错误的细菌染色中偶然发现了一种染色方法，通过此法染色后可将细菌分为两大类——革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。从此建立了具有重要意义的鉴别细菌的染色法——Gram染色法。由此可见，革兰氏染色法距今已有130多年的历史。 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经番红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。 染色结果革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

关于革兰染色的理论假说非常多，但普遍采信的主要是电荷学说和多聚物学说。其中电荷学说认为细菌带负电荷，容易吸附结晶紫等带正电荷的碱性染料。煤染时，结晶紫与碘在细胞壁内形成结晶紫-碘弱结合的共价复合物，呈现紫色。而多聚物学说则认为是结晶紫与碘反应后再与细菌胞内的多聚磷酸盐发生共价结合。
革兰氏阳性菌无外膜，且细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇、丙酮等有机溶剂脱色处理时，首先因失水使网孔缩小，故乙醇无法进一步破坏溶解结晶紫-碘弱结合的共价复合物，因此结晶紫-碘复合物仍留在壁内/胞内，使其仍呈紫色。
革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇乙醇等脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此脱色后阴性菌呈无色。
最后经沙黄等红色染料复染，革兰阳性菌依然呈现紫色，而革兰氏阴性菌最终呈现沙皇的颜色——红色。 既然革兰染色可以把细菌分为两大类，一种菌如果不属于阳性，那就应该属于阴性，这样认为对吗？这是对的，所有的细菌的确是这样，不属于阳性就属于阴性。尽管在实践中革兰染色可能会把原本阳性的细菌染色为阴性，也可能把阴性的细菌染为阳性。这当中既有技术不足的问题，也有细菌本身的问题。例如阴道加德纳尔菌本身是一种阳性菌，但由于肽聚糖比其他阳性菌含量低，容易被脱色为阴性，甚至阴阳性同时存在于一张片子上。与次类似的还有第三梭菌。相应的情况，鲍曼不动杆菌由于外膜较为坚韧，且肽聚糖也较其他阴性菌含量略高，因而不容易被脱色，可能会被染色为阳性。但这并不会影响细菌本身的属性，其染色属性是由其细胞壁结构导致的。
另外，需要大家注意的是分枝杆菌。由于分枝杆菌细胞壁含有特殊的脂肪酸——分枝菌酸与蜡质，这导致其革兰染色不易着色，但采用纯培养物，以及延长革兰染色每一步的时间时，可以证明其为革兰阳性杆菌。其抗酸染色特性也是基于其细胞壁结构的另外一种属性。 1、注意涂片不宜过厚，勿使细菌密集重叠，影响脱色效果，否则脱色不完全造成假阳性。镜检时应以视野内分散细胞的染色反应为标准。
2、火焰固定温度要适宜，以玻片不烫手为宜，否则菌体细胞变性。
3、滴加染色液与酒精时一定要覆盖整个菌膜，否则部分菌膜未受处理，亦可造成假象。
4、乙醇脱色是革兰氏操作的关键环节。如脱色过度，则G+被误染成G-菌，而脱色不足，G-被误染成G+菌。在染色方法正确无误的前提下，如菌龄过长、死亡或细胞壁受损伤的G+也会呈阴性反应，故革兰氏染色用要对数生长期的幼龄培养物。
5、染色过程的时间控制。应根据季节、气温调整。一般冬季时间可稍微长些，夏季可稍微短些。