酵母RNA分离的应用

背景^[1-6]

酵母RNA分离是用TransZol Up裂解样品，加入氯仿后，溶液分为无色水相和粉红色有机相，RNA在水相中；用硅胶膜离心柱特异吸附水相中的RNA，与其它总RNA提取方法相比，既具有TransZol Up裂解能力强、提取量高，应用范围广的优点。酵母是一种具有特殊细胞壁结构的真菌，其细胞壁是由内层葡聚糖的细纤维，覆盖在细纤维上面的中间层糖蛋白和外层甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯键共价连接，形成复杂的，紧密交联的网状结构。与细菌细胞壁一样，酵母细胞壁比其它种类的细胞壁都相对会厚，并且交联又紧密，所以这就给RNA的提取纯化工作带来很大困难。

目前，市场中酵母RNA提取的产品均很难对酵母细胞壁进行有效地破碎，TRIZOL主要成份是异硫氰酸胍和苯酚，没有有效破壁的成分，提取的酵母总RNA利用电泳分析只具有5s rRNA，很显然不完整；玻璃珠型的不是破碎不充分，得率低，就是破碎太剧烈片段断裂，很难掌控；而利用传统的苯酚法提取，要经过组织匀浆，苯酚处理而后乙醇沉淀等一些列步骤，虽然最后能得到生物活性的RNA。但步骤复杂，耗时较长且不利于多个样品同时操作，也并非理想的提取方法。后来有些公司虽然对以上方法又作出了改进，但提取效果仍不是很理想。

酵母菌是一些单细胞真菌，目前已知的酵母菌有1000多种。酵母菌有三类：子囊菌、担子菌和“假酵母”。目前已知大部分酵母都属于子囊菌门，这是一种产生孢子的菌。酵母菌主要生长在潮湿或液态环境，有些也会生存在生物体内。目前，尤其是食品行业中，酵母菌显得异常兴盛，比如啤酒发酵，酸奶污染等都与酵母息息相关。所以，科研人员对酵母菌的研究工作也是越来越热。

总RNA提取的纯度与完整性，对于许多分子生物学实验的进展都至关重要，比如，Northern印迹及杂交分析，cDNA文库构建等，这些实验的成败在很大程度上取决于总RNA的提取质量。对于RNA含量丰富，易于破碎的样品来说，高质量RNA的提取并非难事，但对于破壁较为困难的材料——酵母来说，就并非人人都能很好地提取出高质量的RNA。

应用^[7][8]

可用于树干毕赤酵母cDNA文库构建及EST序列测定：

将植物纤维水解液中30%左右的木糖有效利用转化为酒精是降低酒精生产成本的关键。树干毕赤酵母是研究得最多、最具工业应用前景的木糖发酵酵母,目前对于树干毕赤酵母木糖代谢的生理学机制还知之甚少。以cDNA文库为基础的EST（Expressed Sequence Tag,表达序列标签）技术是一种快速的进行基因功能分析及发现新基因的有效方法。

以约900mg（干重）酵母为材料提取获得了约1.2mg总RNA,提取得率达到1.3‰,提取出的RNA具备完整性,质量高,是cDNA文库构建的良好材料。以提取出的RNA为材料,纯化出mRNA（messager RNA,信使RNA）,经反转录酶反转录出cDNA链,以置换合成法合成cDNA双链,通过胶纯化回收的方法筛选出其中大于500bp的片段与载体连接,最后用电转化法转化宿主菌,构建出树干毕赤酵母P5776的cDNA文库,经质量检测,初级文库滴度达到1.0×106pfu（plaque forming units,噬菌斑形成单位）/mL,扩增文库总克隆数达到1.25×109,文库中71%的重组子插入片段大于300bp,达到cDNA文库构建要求,完全可以用于大规模EST序列测定及数据分析。

参考文献

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[8]范一民.树干毕赤酵母cDNA文库构建及EST序列测定[D].南京林业大学,2005.