罗氏菌素：生物炼制中的中间体与代谢抑制因子

介绍

罗氏菌素（3-hydroxypropionaldehyde, 3-HPA）是微生物转化甘油生产1,3-丙二醇（1,3-PD）过程中的核心中间代谢产物，同时也是一种具有广谱抑菌活性的天然化合物。然而，在发酵过程中，中间产物3-HPA的异常积累会导致细胞生长停滞、代谢活性下降，最终使发酵提前终止，严重影响1,3-丙二醇的产量和生产效率。在水溶液中主要以单体、水合物和环状半缩醛三种形式存在，其中二聚体是其主要存在形式。这种二聚体的结构与D-核糖类似，能够模拟核糖与酶的活性位点结合，从而产生生物学效应。

图一 罗氏菌素

生物合成途径

在微生物体内，罗氏菌素主要通过甘油脱水酶催化甘油脱水生成。该反应需要辅酶 B₁₂作为辅因子，是甘油转化为 1,3 - 丙二醇的第一步限速反应。生成的 3-HPA 随后在 1,3 - 丙二醇氧化还原酶的作用下，利用 NADH 作为还原剂被还原为 1,3 - 丙二醇。正常情况下，这两步反应速率保持平衡，3-HPA 不会在细胞内大量积累。但当甘油浓度过高、溶氧不足或酶活性失衡时，甘油脱水酶的催化速率会超过 1,3 - 丙二醇氧化还原酶的转化能力，导致 3-HPA 在胞内和胞外快速积累。

生物学效应

广谱抑菌活性

罗氏菌素是罗伊氏乳杆菌等益生菌产生的天然抗菌物质，具有广谱的抑菌活性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌均有抑制作用。其抑菌机制主要包括两个方面：一是 3-HPA 能够与蛋白质和小分子中的巯基发生反应，破坏酶的活性中心和细胞结构，导致细胞代谢紊乱；二是诱导细胞内产生活性氧（ROS），引发氧化应激反应，损伤 DNA、蛋白质和脂质等生物大分子。

对微生物的毒性作用

尽管罗氏菌素是微生物自身代谢的产物，但高浓度积累会对细胞产生强烈的毒性。对于肺炎克雷伯氏菌等生产菌株，3-HPA 的毒性主要表现为抑制细胞生长、降低酶活性、破坏细胞膜完整性等。研究表明，当发酵液中 3-HPA 浓度超过 10 mmol/L 时，细胞生长会完全停止，发酵过程被迫终止。早期研究认为其主要通过抑制核糖核苷酸还原酶的活性，阻断 DNA 合成，从而抑制细胞分裂。3-HPA 对细胞代谢的影响更为迅速和复杂。当发酵液中 3-HPA 浓度在 10 分钟内从 1.19 mmol/L 升高到 7.5 mmol/L 时，尾气中 CO₂和 O₂的浓度在 15 分钟内就发生了显著变化，这一快速响应时间远短于 DNA 合成抑制所需的时间，说明 3-HPA 并非主要通过抑制 DNA 合成发挥毒性作用，而是直接作用于细胞内的酶系统和能量代谢途径。

对肺炎克雷伯氏菌关键酶的抑制机制

当罗氏菌素浓度达到 7.5 mmol/L 时，9 种酶的活性均受到不同程度的抑制，残留活性范围为 9.44%~74.68%，表现出明显的非特异性抑制特征。在被检测的 9 种酶中，甘油激酶的残留活性最高，为 74.68%，说明其对 3-HPA 相对不敏感；而富马酸还原酶和甘油脱氢酶的残留活性最低，分别仅为 9.44% 和 9.58%，是 3-HPA 作用的主要靶点。罗氏菌素对酶的抑制作用并非基于简单的结构相似性，可能与酶的活性中心结构、底物结合特性以及翻译后修饰等因素有关。

对细胞能量代谢的快速影响

尾气中 CO₂和 O₂浓度的变化是反映细胞呼吸强度和能量代谢状态的重要指标。当罗氏菌素浓度达到 6.85 mmol/L 时，尾气中 O₂的含量从 2.25% 下降到 1.43%，CO₂的含量从 0.83% 下降到 0.52%，整个过程仅用了 15 分钟。当 3-HPA 浓度进一步升高到 12.45 mmol/L 时，O₂消耗和 CO₂产生几乎完全停止，细胞进入代谢休眠状态。证实了 3-HPA 对细胞代谢的抑制作用发生在翻译后水平，直接影响了电子传递链和中心碳代谢途径中的酶活性。3-HPA 可能通过与酶分子中的巯基、氨基等活性基团结合，改变酶的空间构象，导致酶失活，从而迅速阻断细胞的能量产生和物质代谢。

缓解3-羟基丙醛抑制效应

罗氏菌素的积累是制约1,3-丙二醇生物法工业化生产的关键问题，目前主要的解决方法包括工艺优化、在线监测和基因工程改造三个方面。

发酵工艺优化

通过优化发酵工艺参数，控制甘油的添加速率和溶氧水平，可以有效避免罗氏菌素的过量积累。研究表明，采用脉冲式甘油补料策略，将发酵液中甘油浓度维持在 5~10 g/L 的较低水平，可以使甘油脱水酶和 1,3 - 丙二醇氧化还原酶的活性保持平衡，减少 3-HPA 的积累。此外，适当提高搅拌转速和通气量，增加发酵体系的溶氧，也可以促进细胞的呼吸代谢，提高 3-HPA 的转化效率。

图二 以1,3-PD补料发酵的生物量、O2消耗和CO2合成曲线

在线监测与反馈控制

由于罗氏菌素的积累具有突发性和快速性，传统的离线检测方法难以实时反映其浓度变化。开发 3-HPA 的在线监测技术，建立基于实时浓度的反馈控制系统，是预防 3-HPA 过量积累的有效手段。目前，基于比色法、电化学法和光谱法的在线检测技术正在研发中，这些技术可以实现对发酵液中 3-HPA 浓度的实时监测，及时调整甘油补料速率和搅拌转速，避免发酵过程失控。

基因工程改造

通过基因工程手段改造生产菌株，提高其对罗氏菌素的耐受性和转化能力，是从根本上解决 3-HPA 抑制问题的方法。目前，主要的改造策略包括：过表达 1,3 - 丙二醇氧化还原酶基因，提高 3-HPA 向 1,3 - 丙二醇的转化速率；敲除甘油脱氢酶等对 3-HPA 敏感的酶基因，减少代谢支路的竞争；引入外源的 3-HPA 降解途径，降低胞内 3-HPA 的浓度。此外，通过适应性进化和诱变育种，也可以筛选获得对 3-HPA 耐受性显著提高的突变菌株[1]。

参考文献

[1] ZHENG Z M, WANG T P, XU Y Z, et al. Inhibitory mechanism of 3-hydroxypropionaldehyde accumulation in 1,3-propanediol synthesis with Klebsiella pneumoniae[J]. African Journal of Biotechnology, 2011, 10(35): 6794-6798. https://doi.org/10.5897/AJB11.825.