柚苷酶的酶学性质及用途

背景及概述^[1-2]

果汁加工过程中，对影响其品质的许多物质必须进行处理，以提高产品的质量，延长保质期。酶法脱苦中研究较多的是柚苷酶，它能作用于黄烷酮糖苷类化合物柚皮苷从而对果汁进行脱苦。柚苷酶主要含有两种酶，一种是鼠李糖苷酶，可将苦味的柚苷(柚苷质-7-芸香糖苷)分解成鼠李糖和无苦味的柚配质-7-葡萄糖，柚苷酶是一种诱导酶。另一种是β-葡萄糖苷酶，可将柚配质-7-葡萄糖水解成柚配质和葡萄糖。本酶的最适宜pH值为3.5～5.0。最适温度为50～60℃。

酶学性质^[2]

柚苷酶是由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成的混合酶，具有α-L-鼠李糖酶和β-D-葡萄糖苷酶的活性。采用色谱法从土曲霉CECT2663中分离到柚苷酶的混合体系。在pH5.5和pH4.7条件下进行两步分离，得到了单一组分的α-L-鼠李糖苷酶和含有两种组分的β-D-葡萄糖苷酶(βG1和βG2)。进一步研究发现，在pH4～6和温度65℃时，β-D-葡萄糖苷酶的酶活；βG1和βG2都能作用于对硝基葡萄糖苷和普鲁宁，βG1的Km值为1.9mmol/L和1.6mmol/L，βG2的Km值为2.1mmol/L和0.25mmol/L，只有βG1能水解纤维二糖。

Puri等从黑曲霉1344中分离得到了柚苷酶的二聚体，酶活为867U/mg蛋白。又通过对葡萄糖和鼠李糖的特征值Km、Vmax、Ki进行分析，推测它可能有两个催化活性位点，两个活性位点通过化学修饰维持酪氨酸的存在，酪氨酸是酶活的关键部分。来源于黑曲霉的柚苷酶的酶活随着蛋白质浓度和pH值的变化而变化，鼠李糖苷酶的酶活在pH值3～7时，几乎不受pH值的影响，葡萄糖苷酶的活性在pH值4～6的范围最适宜。黑曲霉来源的柚苷酶表现为一个酶具有两个活性位点，一个为α-L-鼠李糖苷酶活性位点，另一个为β-D-葡萄糖苷酶活性位点。

酶解特征^[2]

从分子结构对柚苷酶的作用机制进行描述的文献非常少。它水解柚皮苷主要分两步完成，柚皮苷(4'-5，7'-三羟基二氢黄酮-7-鼠李糖葡萄糖苷)被鼠李糖苷酶水解为鼠李糖和普鲁宁，普鲁宁的苦味约为柚皮苷的三分之一；普鲁宁又在β-D-葡萄糖苷酶的作用下被水解为无苦味的柚皮素和葡萄糖。因此，柚苷酶水解反应的步是脱苦的关键。用高效液相色谱法证实这一水解顺序，并指出仅有β-D-葡萄糖苷酶存在时，柚皮苷不能被水解。

用途^[2]

目前柚苷酶主要被应用于果汁的脱苦。除此外，它还被应用在其他方面。

1. 生产抗生素

利用柚苷酶中鼠李糖苷酶的生物活性，可以生产抗生素chloropolysporin，它是一类去糖基化的糖肽类抗生素。chloropolysporinsA、B和C能被酶解转化为去糖基化产物。chloropolysporinC抗生素和内酰胺抗生素联合使用，能增强对耐甲氧葡萄球菌类的作用。chloropolysporins对革兰氏阳性菌有强烈的抑制作用，包括耐甲氧西林葡萄球菌和厌氧型革兰氏阳性肠道菌。一般而言，chloropolysporinC是chloropolysporin化合物中活力最高的组分，它的活性高于β-avoparcins。

2. 生产鼠李糖

用高活性的鼠李糖苷酶和低活性的葡萄糖苷酶混合体系组成的柚苷酶水解柚皮苷能生产鼠李糖。鼠李糖能用于制备药和植物保护剂。

3. 生产普鲁宁

将固定化柚苷酶用碱性缓冲液处理后，水解柚皮苷能生产普鲁宁。产品的得率较高。普鲁宁具有抵抗DNA/RNA病毒的活性。类黄酮具有反炎症的活性，可被用作糖尿病人的代甜食。许多天然类黄酮发现具有抗DNA或RNA病毒的可变光谱特征。通过细胞的体外培养，类黄酮柚皮苷、hesperitin和普鲁宁对HSV-1(poliovirustype-1)、Pf-3(parainfluenzavirustype-3)和RSV(respiratorysyncytialvirus)病毒的感染和复制正在研究。据报道，通过动物模拟实验，二氢黄酮类糖配基柚皮素能预防胃溃疡。柚皮素本身对酒精引起的胃病有作用。

4. 转化类固醇

胡芦巴籽能够被柚苷酶酶解生产皂角苷和薯蓣苷(一种临床有用的类固醇药)。在这个过程中，固定化柚苷酶和果胶酶可被重复使用两次而薯蓣苷不会损失。

5. 其他

鼠李糖苷酶，β-葡萄糖苷酶和阿拉伯糖苷酶相互作用，能提高葡萄酒的风味，这主要是利用柚苷酶中鼠李糖苷酶的生物活性。将真菌葡萄糖苷酶固定在固体载体上，其目的是连续作用于葡萄酒，促进风味的改善，增加酒的风味，同时也对系统的动力学行为和固定化进行了研究。将淀粉酶、多聚半乳糖醛酸酶和柚苷酶共固定用于果蔬汁中淀粉和果胶的水解，效果比单独固定淀粉酶和果胶酶好。将柚苷酶分别固定在甲壳素、壳聚糖和DE-壳聚糖上，结果显示均能增强葡萄酒的风味。

制备^[3-4]

方法1：一种制备纯化柚苷酶的方法，其具体操作步骤如下：1)采用常规微生物接种方法接种：试管斜面培养，采用察氏固体培养基；移接：将上述生长的菌株移接到产孢固体培养基中，25-35℃，培养3-5天，至孢子按0.5-10.0％接种量投加到固体培养基中，控制碳氮比例在2-5：1-3.5范围内，加有机磷，其含量为5-8％。干基，保持湿度30-70％，温度25-35℃，自然PH值，柚苷酶产生时间为40-90小时；上述菌株孢子添加到固体培养基中的碳为麦麸；所属固体培养基中的氮为豆渣和豆饼；所述真菌菌种为黑曲霉；所述柚苷酶生产时间为60-90小时；柚苷酶产生时间为72小时.

方法2：一种生产柚苷酶的方法，包括以下步骤：

（1）将保藏号为CGMCCNo.9928的解淀粉芽孢杆菌11568进行斜面培养，得斜面菌种；

（2）取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在40.9℃、180rpm的条件下发酵培养48h，得液体发酵液；

（3）离心分离液体发酵液，取上清液；

（4）上清液经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、SephacrylS-200凝胶过滤层析，得到柚苷酶。

主要参考资料

[1] 实用精细化工辞典

[2] 柚(皮)苷酶的研究进展

[3] CN200610068680.6一种制备纯化柚苷酶的方法及其酶制剂的应用

[4] CN201410779845.5一种生产柚苷酶的方法