PSMC3抗体的应用

背景^[1-3]

PSMC3抗体（28-K）是一种IgG1κ小鼠单克隆PSMC3抗体（也称为PSMC3抗体），可通过WB、IP和ELISA检测小鼠、大鼠和人类来源的PSMC3蛋白。PSMC3抗体（28-K）提供非偶联形式的抗PSMC3抗体。在真核细胞中，细胞蛋白的选择性分解是通过它们的泛素化以及随后被26S蛋白酶体降解来实现的。26S蛋白酶体是一种蛋白酶复合体，能够选择性分解被多聚泛素链修饰的蛋白质。它由两个多亚基复合体组成：一个是作为复合体蛋白水解核心的20S蛋白酶体室，以及两个能够识别和展开泛素化蛋白质的19S调节颗粒。PSMC3（蛋白酶体26S亚基ATPase 3），也称为TBP1（Tat结合蛋白1），是AAA ATPase家族的439个氨基酸成员。PSMC3定位于细胞核和细胞质中，作为19S调节复合体的一个亚基，参与调节26S蛋白酶体的底物特异性。此外，PSMC3与HIV蛋白HIV-1 Tat相互作用，并通过这种相互作用介导病毒蛋白与转录复合体的结合。

PSMC3（26S蛋白酶调节亚基6A）也称为TBP1，蛋白酶体26S亚基ATP酶3，属于AAA ATP酶家族。26S蛋白酶参与泛素化蛋白的ATP依赖性降解。它是一种多功能蛋白，是蛋白酶体调节亚基的组成部分，参与不同的细胞过程。

PSMC3抗体

PSMC3抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（PSMC3抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(PSMC3抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

PSMC3抗体可以用于DFFA和PSMC3在RNA干扰功能中的调控作用

RNA干扰是一种由siRNA或dsRNA介导的基因沉默表达的方式。通过与靶mRNAde特异性结合,这些小RNA与Argonaute(AGO)蛋白及相关因子形成RNA诱导的沉默复合体(RISC),后者完成对靶mRNA的剪切或者翻译抑制。前面通过酵母双杂交筛选出与人类Argonaute2(Ago2)相关蛋白——DFFA和PSMC3,本实验在此基础上,进一步通过免疫共沉淀验证它们与Ago2相互作用的特异性,通过荧光实验,我们推测这两种蛋白在体内miRNA或者siRNA介导的mRNA剪切中发挥着重要功能。

方法：利用PSMC3抗体免疫共沉淀的方法在细胞内验证DFFA、PSMC3同人类Ago2蛋白之间相互作用的特异性,通过GST pull-down验证DFFA同Argonaute2 PIWI结构域(hAgo2 PIWI)体外结合作用。构建内源性miR-21介导的GFP阳性Read-Out报告系统,通过该系统验证在分别敲除DFFA和PSMC3的情况下,被抑制的GFP表达效果是否得以增强；利用siRNA-GFP和表达GFP的质粒作为研究siRNA介导的GFP表达抑制,观察在分别敲除DFFA和PSMC3的情况下GFP的表达强度变化,间接推测两者在由小RNA介导的RNA干扰过程中的功能。

PSMC3抗体结果：1.免疫共沉淀证实外源性DFFA和PSMC3同转染的hAgo2 PIWI存在着特异的相互作用。进一步的实验证明,DFFA和PSMC3 Flag融合蛋白的N端结构域可能与全长的hAgo2蛋白相互结合。2.通过GST-pull down体外结合实验证实DFFA同hAgo2 PIWI的相互作用。3.敲除了DFFA、PSMC3对miR-21介导的内源封闭报告系统产生的积极地作用。4.敲除了DFFA、PSMC3对si-GFP介导的GFP抑制产生了逆转的效果。结论：DFFA在体内、体外均同hAgo2 PIWI存在着相互作用,PSMC3在体内同hAgo2 PIWI存在着相互作用；DFFA和PSMC3 Flag融合蛋白的N端结构域可能与全长的hAgo2蛋白相互结合。敲除实验证实DFFA、PSMC3均参与了由miRNA或者siRNA介导的mRNA剪切过程,推测两者可能是新的RISC组件。

参考文献

[1]NA Helicase A Interacts with RISC in Human Cells and Functions in RISC Loading[J].G.Brett Robb;;Tariq M.Rana.Molecular Cell,2007(4)

[2]Argonaute Proteins:Mediators of RNA Silencing[J].Lasse Peters;;Gunter Meister.Molecular Cell,2007(5)

[3]Translation Repression in Human Cells by MicroRNA-Induced Gene Silencing Requires RCK/p54[J].Chia-ying Chu;;Tariq M Rana.PLOS Biology,2006(7)

[4]Argonaute:a scaffold for the function of short regulatory RNAs[J].James S.Parker;;David Barford.Trends in Biochemical Sciences,2006(11)

[5]魏晓明.DFFA和PSMC3在RNA干扰功能中的调控作用[D].天津医科大学,2008.