C-ABL抗体的应用

背景^[1-3]

C-ABL抗体是一种IgG1κ小鼠单克隆c-Abl抗体（也称为ABL1抗体、ABL原癌基因1抗体或非受体酪氨酸激酶抗体），可通过WB、IP、IF、IHC(P)和ELISA检测小鼠、大鼠和人类的c-Abl蛋白。c-Abl抗体（8E9）既可以作为非共轭抗c-Abl抗体，也可以作为多种共轭形式的抗c-Abl抗体，包括琼脂糖、HRP、PE、FITC和多种共轭物。Abl癌基因最初被鉴定为Abelson小鼠白血病病毒（A-MuLV）的病毒转化基因。c-Abl的主要翻译产物已被鉴定为具有酪氨酸激酶活性和SH2结构域的蛋白质。Abl癌基因与几种人类白血病有关，包括90-95%的慢性髓细胞白血病（CML）、20-25%的成人急性淋巴细胞白血病（ALL）和2-5%的儿童ALL。在这些白血病中，c-Abl原癌基因经历（9；22）染色体易位，产生费城（Ph1）染色体。这种易位的分子结果是产生编码活化的Abl蛋白酪氨酸激酶的嵌合Bcr/c-Abl mRNA。已证明Bcr基因编码一种针对Ras相关GTP结合蛋白p21rac的GTP酶激活蛋白（GAP）。

C-ABL抗体

C-ABL抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（C-ABL抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(C-ABL抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

C-ABL抗体可以用于c-Abl在上皮性卵巢肿瘤中的表达及其恶性行为作用机制的初步探讨

c-Abl在上皮性卵巢肿瘤中的表达及其临床意义目的检测在不同EOC标本中c-Abl蛋白表达情况，探讨c-Abl的表达与EOC患者临床病理特征之间的关联性。

方法：（1）采用C-ABL抗体免疫组织化学测定22例正常卵巢组织，28例良性卵巢肿瘤组织，18例交界性卵巢肿瘤组织及137例EOC组织标本中c-Abl的表达情况，分析c-Abl的异常表达与其临床病理特征的相关性。（2）采用C-ABL抗体Western blot测定18例正常卵巢组织标本，17例卵巢良性肿瘤组织标本，14例卵巢交界性肿瘤组织标本和32例EOC组织标本中c-Abl的表达情况，分析c-Abl的异常表达与其临床病理特征的相关性。（3）应用Kaplan-Meier生存分析比较不同EOC组织标本中c-Abl表达强弱对患者生存时间的影响；Cox回归分析研究关于EOC患者生存时间的相关影响因素。（4）采用C-ABL抗体Western blot检测不同人卵巢癌细胞株（SKOV3、3AO、OVCAR-3、ES-2）中c-Abl蛋白表达情况，应用激光共聚焦显微镜技术探究c-Abl在人卵巢癌细胞株中的亚细胞定位。

C-ABL抗体结果：（1）免疫组化结果显示，在137例EOC组织标本中，c-Abl呈强阳性表达有94例（68.6%），低表达或不表达者有43例（31.4%）；在正常卵巢组织21例（95.5%）、卵巢良性肿瘤24例（85.7%）及卵巢交界性肿瘤14例（77.8%）呈c-Abl不表达，差异有显著统计意义（P＜0.05）。在EOC中，FIGO分期中III～IV期的c-Abl蛋白表达水平显著高于I～II期组织（P＜0.001），c-Abl表达水平在病理分化程度为中低分化显著高于高分化者（P＜0.001），c-Abl表达水平在EOC患者血浆Ca-125≥35U/ml的显著高于Ca-125＜35U/ml（P=0.019），c-Abl表达在术后残余肿瘤直径≥1cm的EOC患者显著高于术后残余肿瘤直径＜1cm者（P=0.015），但与EOC患者腹水情况、病灶单双侧、年龄、肿瘤大小及病理学类型无关（P＞0.05）。（2）C-ABL抗体Western blot结果显示，EOC组织标本中c-Abl的表达显著高于正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织及卵巢交界性肿瘤组织(分别为：1.704±0.382，0.317±0.062，0.334±0.066，0.346±0.068)，差异有显著统计学意义（P＜0.05）。在EOC组织中，c-Abl蛋白表达水平与EOC组织分化程度、术后残余肿瘤直径大小、患者血浆Ca-125水平、FIGO肿瘤分期有关（P＜0.05），而与EOC患者腹水情况、病灶单双侧、年龄、肿瘤大小及病理学类型无关（P＞0.05）。（3）Kaplan-Meier生存分析显示，c-Abl高表达的EOC患者生存时间显著短于c-Abl低表达的患者（P＜0.05），多变量分析表明不满意的肿瘤细胞减灭术、c-Abl高表达和FIGO分期中晚期可能是EOC预后的独立因素。（4）c-Abl在SKOV3、3AO、ES-2、OVCAR-3中的表达分别为：1.044±0.138，0.905±0.096，0.943±0.170，0.855±0.750；通过激光共聚焦显微镜观察到c-Abl与肌动蛋白共表达于细胞膜和细胞质上。

参考文献

[1]Overexpression of cysteine cathepsin L is a marker of invasion and metastasisin ovarian cancer[J].Wei Zhang;;Sumei Wang;;Qi Wang;;Zhijun Yang;;Zhongmian Pan;;Li Li.Oncology Reports,2014(3)

[2]Metastatic Stem Cells:Sources,Niches,and Vital Pathways[J].Thordur Oskarsson;;Eduard Batlle;;Joan Massagué.Cell Stem Cell.2014

[3]Cancer diagnostic classifiers based on quantitative DNA methylation[J].Lorincz.Expert Review of Molecular Diagnostics,2014(3)

[4]Effects of lentiviral-mediated Foxp1 and Foxq1 RNAi on the hepatocarcinoma cell[J].Jing Qin;;Yuyin Xu;;Xingyu Li;;Yuanyuan Wu;;Jiaming Zhou;;Guilan Wang;;Li Chen.Experimental and Molecular Pathology.2014

[5]周碎央.c-Abl在上皮性卵巢肿瘤中的表达及其恶性行为作用机制的初步探讨[D].重庆医科大学,2014.