KHSRP抗体的应用

背景^[1-3]

KHSRP抗体是无偶联基团的、靶向KHSRP的IgG抗体(克隆号：YA2143)，预测分子量为73 kDa(实际观测：82 kDa)。KHSRP Antibody(YA2143)可用于人、小鼠、大鼠背景下的WB、IHC-P、ICC/IF、IP实验。

KHSRP相关基因编码一种多功能RNA结合蛋白，该蛋白涉及多种细胞过程，包括转录、选择性前mRNA剪接和mRNA定位。

KHSRP抗体

KHSRP抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（KHSRP抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(KHSRP抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

KHSRP抗体可以用于KHSRP在坐骨神经损伤后的表达及功能研究

研究KHSRP在坐骨神经损伤后的表达情况,探究KHSRP与施万细胞分化和神经元轴突再生的关系,分析KHSRP与β-catenin的相互调节关系及两者在施万细胞分化和神经元轴突再生过程中的作用,进一步揭示KHSRP在周围神经损伤后的再生机制。

方法1.为了研究KHSRP在损伤后坐骨神经中的表达,本研究通过构建大鼠坐骨神经夹伤模型,利用KHSRP抗体western blot,免疫组织化学技术检测了KHSRP在正常组织及损伤组织中的表达；采用免疫荧光方法检测了KHSRP的细胞定位情况,分析其与施万细胞分化和神经元轴突再生的关系；

2. 为了研究KHSRP在施万细胞分化过程中的作用,本研究通过构建原代施万细胞体外分化模型,KHSRP抗体western blot及RT-PCR技术检测KHSRP、β-catenin及相关蛋白在此过程中的表达情况；通过核浆分离检测KHSRP的胞浆转移情况；通过构建KHSRP小干扰RNA及β-catenin过表达质粒并结合免疫细胞荧光技术检测KHSRP是否通过调节β-cateni n的稳定性从而介导施万细胞的分化。

3. 为了研究KHSRP在神经元突起生长过程中的作用,采用100ng/ml NGF刺激未分化的PC12细胞,模拟神经元体外分化过程,以及构建原代DRG神经元体外发育模型,KHSRP抗体检测KHSRP在神经元延伸过程中的表达、胞浆转运及对神经元突起延伸的影响。

4. 原代施万细胞和神经元的共培养,模拟坐骨神经损伤后施万细胞的再成髓鞘化过程,检测KHSRP、β-catenin的表达及KHSRP的胞浆运输对β-catenin稳定性的影响。

KHSRP抗体结果1.western blot免疫组化分析显示,KHSRP在坐骨神经损伤后表达升高,在第5天达到最高,随后逐渐回复。免疫荧光结果显示KHSRP NF200、S100及Oct-6阳性的细胞中均有表达,提示KHSRP可能在施万细胞分化和神经元轴突再生过程中发挥作用。2.在cAMP诱导的施万细胞分化过程中,KHSRP的表达升高,而β-catenin的表达降低。核浆分离结果显示KHSRP在分化过程中胞浆蛋白水平增加,相应此时β-catenin的胞浆蛋白水平降低,提示KHSRP可能通过调节β-catenin的稳定性来介导施万细胞的分化。KHSRP的小干扰RNA转染施万细胞后抑制了施万细胞分化的形态发生,该效应与过表达β-catenin的施万细胞形态相似。3.NGF刺激PC12细胞分化和体外培养的原代DRG神经元发育的过程中,KHSRP的蛋白及mRNA水平的表达均升高,而β-catenin成相反趋势。此外也相应观察到KHSRP的胞浆聚集及β-catenin的胞浆稳定性降低现象。KHSRP的小干扰RNA转染的PC12或DRG神经元突起延伸也受到影响。

参考文献

[1]MicroRNA turnover:when,how,and why[J]..Trends in Biochemical Sciences,2012(10)

[2]KSRP:A checkpoint for inflammatory cytokine production in astrocytes[J].Xuelin Li;;Wei‐Jye Lin;;Ching‐Yi Chen;;Ying Si;;Xiaowen Zhang;;Liang Lu;;Esther Suswam;;Lei Zheng;;Peter H.King.Glia,2012(11)

[3]Perspectives on the ARE as it turns 25 years old[J].Daniel Beisang;;Paul R.Bohjanen.WIREs RNA,2012(5)

[4]microRNA-206 promotes skeletal muscle regeneration and delays progression of Duchenne muscular dystrophy in mice[J].Liu,Ning;;Williams,Andrew H;;Maxeiner,Johanna M;;Bezprozvannaya,Svetlana;;Shelton,John M;;Richardson,James A;;Bassel-Duby,Rhonda;;Olson,Eric N.EN,2012(6)

[5]朱小建.KHSRP在坐骨神经损伤后的表达及功能研究[D].苏州大学,2015.