HSL抗体的应用

背景^[1-3]

HSL抗体是一种可以特异性结合HSL的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的HSL蛋白。HSL抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

LIPE，也称为HSL和LHS，属于“GDXG”脂肪分解酶家族。在脂肪组织和心脏中，它主要将储存的甘油三酯水解为游离脂肪酸，而在类固醇生成组织中，它主要将胆固醇酯转化为游离胆固醇以产生类固醇激素。LIPE有两种亚型，分子量分别为117 kDa和84 kDa。

HSL抗体

HSL抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（HSL抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(HSL抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

HSL抗体可以用于Grb14通过HSL促进肝脏细胞脂肪分解的作用机理

甘油三酯(TG)作为动物体内脂肪最主要的贮存形式之一,在机体缺乏外界能量供给或需要脂肪分解提供能量时,TG在脂肪酶如脂肪甘油三酯酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)、单酰基甘油脂肪酶(MGL)等作用下释放出游离的脂肪酸(FA)和甘油。脂解代谢除了受这些分解酶的调控,还受各种生长因子、激素、转录因子等调控,当这些过程出现异常时,机体可能会产生各种病症如:肥胖症、代谢综合征、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、高胰岛素血症以及癌症等。生长因子受体结合蛋白14(Grb14)是一种接头蛋白,既往研究表明Grb14通过特异性地抑制胰岛素受体酪氨酸激酶的活性调控葡糖代谢,然而Grb14在脂肪分解代谢中的作用暂不清楚。因此,本研究通过免疫荧光、免疫沉淀、甘油三酯及甘油含量的测定、体外蛋白纯化、实时荧光定量PCR等分子生物学方法分别在蛋白水平及RNA水平探究Grb14在脂肪分解代谢中的作用,旨在揭示Grb14在调控脂肪分解代谢中具体的作用机理。

主要结论如下:(1)Grb14促进肝脏细胞的脂肪分解。在人源肝脏细胞HL-7702中过表达Grb14测定细胞中甘油三酯含量以及培养液中甘油的释放量,结果发现:表达Grb14的细胞中甘油三酯含量较对照组显著下调,甘油的释放量上升。其次在He La细胞中过表达Grb14检测脂滴的变化,免疫荧光结果发现:表达Grb14的细胞中脂滴的数目较对照组明显减少。因此推测Grb14的高表达,促进细胞中脂肪的分解。(2)Grb14与HSL协同促进肝脏细胞的脂肪分解。HSL作为最先发现的脂肪酶,既往研究表明它参与甘油三酯、甘油二酯及胆固醇酯的水解。HSL抗体试验发现Grb14的N端与HSL的N端有相互作用,通过对肝细胞中积累的甘油三酯及培养基中释放的甘油含量的测定,发现Grb14与HSL协同促进细胞中甘油三酯的水解。

HSL抗体免疫荧光试验得到相同的结果,单表达Grb14或HSL的细胞,脂滴含量明显减少,而共表达Grb14与HSL的细胞中,脂滴几乎完全消失。在HL-7702细胞中过表达Grb14发现,脂肪分解相关基因如ATGL,HSL、CGI-58、ADRB、ACOX和LPL在m RNA水平显著上调;敲低Grb14,大多数脂肪分解相关基因的表达显著下调。结果显示:无论在RNA水平还是在蛋白质水平,Grb14都促进肝脏细胞的脂肪分解。(3)Grb14通过调控HSL的水解酶活性与肝脏细胞的自噬促进脂肪的分解。试验结果显示Grb14能直接影响PKA介导的HSL的磷酸化,调控HSL介导的脂滴的水解;同时,Grb14通过影响自噬标记蛋白的含量及自噬底物的积累促进肝细胞中的脂噬,为肝细胞中脂滴的分解提供新的思路。综上所述,Grb14作为肝细胞中HSL的上游元件,一个新的信号节点调控脂解代谢,同时也为脂肪代谢类疾病的药物开发提供新思路。

参考文献

[1]The reduction of lipid-sourced energy production caused by ATGL inhibition cannot be compensated by activation of HSL,autophagy,and utilization of other nutrients in fish[J].Si-Lan Han;Yan Liu;Samwel M.Limbu;Li-Qiao Chen;Mei-Ling Zhang;Zhen-Yu Du.Fish Physiology and Biochemistry.2020

[2]Inhibition of ATGL in adipose tissue ameliorates isoproterenol-induced cardiac remodelling by reducing adipose tissue inflammation.[J].Takahara Shingo;Ferdaoussi Mourad;Srnic Nikola;Maayah Zaid H;Soni Shubham;Migglautsch Anna K;Breinbauer Rolf;Kershaw Erin E;Dyck Jason R B.American journal of physiology.Heart and circulatory physiology.2020

[3]KRAS controls pancreatic cancer cell lipid metabolism and invasive potential through the lipase HSL.[J].Rozeveld Cody N;Johnson Katherine M;Zhang Lizhi;Razidlo Gina L.Cancer research.2020

[4]Lipophagy-derived fatty acids undergo extracellular efflux via lysosomal exocytosis.[J].Cui Wenqi;;Sathyanarayan Aishwarya;;Lopresti Michael;;Aghajan Mariam;;Chen Chi;;Mashek Douglas G.Autophagy.2020

[5]瞿敏.Grb14通过HSL促进肝脏细胞脂肪分解的作用机理[D].安徽大学,2021.