2',7'-二氯荧光素二乙酸酯的应用

发布日期:2024/9/19 16:00:13

染料分子具有种类繁多，良好的荧光性能等优点，是目前应用最为广泛的发光材料，是一种常用的自组装构筑基元。染料分子中通常含有多种功能性基团和杂芳环或芳环等π共辄结构，是构筑荧光自组装体的理想构筑基元。常用的染料分子有罗丹明B、低聚芳经磺酸钠等。染料分子通常能够在多种弱相互作用力如范德华力、T-箕堆积、静电作用和氢键的驱动下，发生自组装聚集行为。^[1]

2',7'-二氯荧光素二乙酸酯是什么？

越来越多的实验研究，就是利用化学荧光指示剂即荧光探针：2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(2',7'-Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)检测细胞内的活性氧，从而研究活性氧在各种病理及生理现象中的变化。2',7'-二氯荧光素二乙酸酯通常被作为一种酶作用底物，来检测细胞内的活性氧以及各种活性氧之间的级联诱导变化。它是一种脂溶性物质，可以穿过细胞膜，被细胞内的酯酶水解生成一种非荧光物质二氯二氢荧光素(2",7'-Dichlorofluorescin ,DCFH)，DCFH继而可以被细胞内的各种活性氧所氧化，转变成一种可以产生荧光信号的物质即二氯荧光素(2',7'-Dichlorofluorescein , DCF)，DCF所产生的荧光信号可以被特定的仪器检测到，比如激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪、分光光度计等。细胞内活性氧的量与DCF的荧光信号成比例，所以可以通过检测这种荧光信号的变化，来了解细胞内的活性氧的变化情况，是一种间接的检测活性氧的方法。有文献报道：所得到的DCF荧光图像并不是被某种单一的活性氧氧化所产生，而是总的活性氧的氧化能力的反映。所以用这种荧光指示剂测定细胞内的活性氧，反映的是细胞内所有活性氧的总的氧化能力，并不是某种特定的活性氧的氧化能力。^[2]

2',7'-二氯荧光素二乙酸酯的应用

ROS包括超氧自由基、过氧化氢及其下游产物过氧化物等，ROS广泛参与体内生理反应。HDCFDA又名2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2',7'-Dichlorodihydrofluorescein,DCFH-DA)，是一种荧光探针指示剂，但是DCFH-DA本身无荧光，而是通过细胞膜进入细胞，被细胞内的酯酶水解生成DCFH，留在细胞内，在细胞内ROS的作用下，DCFH被氧化，生成强荧光产物2',7'-二氯荧光素(2',7'-dichlorofluorescein,DCF），通过检测DCF的荧光来检测细胞内ROS水平。^[3]

陈育婷等采用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（2′，7′- dichlorofluorescin diacetate， DCFH-DA）探针检测发现，Pt-BIC在550 nm光照条件下能够促进细胞内活性氧的产生研究工作不仅为新型铂类药物的设计和开发提供了新策略，也为癌症治疗带来新希望。^[4]

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ROS是指在生物体内与氧代谢有关的、含氧自由基和易形成自由基的过氧化物的总称。ROS在维持正常体内平衡的情况下具有重要的生物学功能，参与宿主防御和细胞信号传导。然而，当ROS水平超过细胞通过自然抗氧化机制的中和能力时，会引发氧化应激，与多种慢性炎症性疾病有关。通过 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 (DCFH‐DA) 法测定 ROS 水平，发现黄芩提取物在不同浓度下均对LPS诱导的斑马鱼ROS 相对荧光强度产生调节作用，表明其具有抗氧化的作用。^[5]

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体外培养Huh-7细胞，设置空白对照组、人参皂苷辛酸酯Rh2-O药物组及阳性对照组（米托蒽醌处理），CCK-8、流式细胞术分别检测细胞活力和凋亡，ELISA及化学发光法分别检测细胞上清高迁移率族蛋白1（HMGB1）和三磷酸腺苷（ATP）含量，免疫荧光法检测细胞钙网蛋白（CRT）的膜外翻，荧光探针2',7'-二氯荧光素二乙酸酯检测细胞内ROS水平，Western blot检测细胞内质网应激信号通路相关蛋白表达。

Rh2-O对Huh-7细胞氧化应激的影响细胞内发生氧化应激会诱导ROS产生，利用荧光探针DCFH-DA对细胞内ROS进行检测，与对照组相比，药物组检测出大量绿色荧光(P<0.05,图5)。说明Rh2-O可诱导Huh-7细胞内ROS表达，刺激细胞氧化应激。

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PMA是一种典型的具有致炎作用的小分子化合物,能明显升高巨噬细胞的氧化应激状态。而2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 DCFH-DA能够在进入胞内后，被水解从而保留在胞内，被氧化为具有绿色荧光的 DCF，荧光强度与ROS水平呈正比。图1显示，在PMA诱导下，巨噬细胞产生大量的ROS，但是经过OXbCD NP处理，细胞ROS量明显降低。说明OXbCD NP具有良好的抵抗PMA所致氧化应激的能力。^[6]

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ROS包括超氧自由基、过氧化氢及其下游产物过氧化物和羟化物等，可参与细胞生长增生、发育分化、衰老和凋亡等生理及病理过程。为初步了解抑制H₂O₂诱导的Muller细胞凋亡的途径，本研究应用DCFH-DA检测NBP高表达对H₂O₂诱导的Muller细胞ER中ROS的表达影响。结果发现，H₂O₂刺激后Muller细胞的ROS水平明显增高，而给予NBP丁基苯酞作用后，细胞中ROS水平显著下降。提示NBP可抑制氧化应激水平。DCFH-DA 本身没有荧光，可以穿过细胞膜，进入细胞内后被细胞内的酯酶水解生成DCFH。在ROS存在的条件下，DCFH被氧化生成荧光物质DCF，检测荧光DCF可了解细胞内ROS水平。绿色荧光的强度与细胞内ROS水平成正比。结果显示，NBP作用后可有效缓解ER中ROS的堆积，进而下调ER应激水平。^[7]