葛根黄酮

【概述】

葛根黄酮是多年生豆科植物葛Pueraria Lebata(willa)ohwi 的根葛根的主要成分之一，具有降低心肌耗氧量, 增加冠状动脉脑血管流量, 缓解心绞痛, 抗心律失常, 抗氧化, 增强机体免疫力, 生津止渴等多种药理作用, 主要用于治疗心脑血管类疾病，如高血压、高血脂、偏头痛、冠心病、心肌梗塞、心绞痛、视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、突发性耳聋等症，同时广泛用于保健食品( 用于解酒、丰胸、延缓女性更年期、糖尿病引起的并发症等) 等领域。

【基源】

葛根为多年生豆科植物葛Pueraria Lebata(willa)ohwi 的根。野葛生于山坡草丛中或路旁及较阴湿的地方, 主要分布于辽宁、河北、河南、山东、安徽、江苏、浙江、福建、台湾、广东、广西、江西、湖南、
湖北、四川、重庆、贵州、云南、山西、陕西、甘肃等地, 广西、广东已有人工栽种。葛根的功效成分主
要有:葛根素、葛根素木糖甙、大豆黄酮、大豆黄酮甙及β 谷甾醇、花生酸、豆甾醇等。

【分类】

葛根黄酮类化合物主要有大豆苷(Daidzin)、大豆苷元(Daidzein)、葛根素(Puerarin)、大豆苷元4', 7-二葡萄糖苷(Daidzein-4' , 7-Diglucoside)、7-木糖苷葛根素(7-Xyloside puerarin)、4', 6”-二乙酰葛根素(4',6”-ODiacetylpuerarin)、7-羟基-4, -甲基氧异黄酮(Formononetin)等。

【制备方法】

1.制备原理

由于葛根中除了黄酮化合物还有大量纤维素和淀粉等高糖物质, 它们与黄酮类化合物在水、醇等溶剂中的溶解毒不同因而可以通过溶剂提取的方法, 使总黄酮溶于溶剂中, 再通过固液分离将目的物分离。

2.提取方法

葛根中的黄酮类化合物的提取工艺迄今为止已有回流法, 浸取法, 超声波提取法等, 其中萃取法, 浸取法, 回流法, 渗漉法, 超声波法, 均可用水提或醇提(两者操作流程大致相仿, 不同之处仅在提取黄酮的溶媒—分别为水及有机溶剂), 且经实验验证, 绝大多数情况下, 醇提法所得产品中总黄酮得率比水提法产品总黄酮得率均为高。
(1)水煎煮法
此法具体操作流程为:取葛根饮片各加10倍量的水, 煎煮3 次, 时间分别3, 1, 0.5 h(效果),过滤, 静置24 h, 取上清液置水浴上浓缩成膏状, 放冷, 至80 ℃烘箱中干燥即得干膏。
(2)碱液法
以碱的水溶液为提取溶剂的浸取法, 此法具体操作流程为:用碱液反复提取葛根, 每次滤液分别定溶至一定体积, 直至滤液颜色浅似无色, 工艺条件为温度4 ℃, 时间2 h , 固液比1∶4 , 碱液浓度5 %下, 浸提2次。
(3)浸取法
以水或有机溶剂对葛根进行反复浸提, 经实验证明, 如使用醇提法在温度85 ℃, pH=8 的条件下,用10 倍于葛根量的浓度为70 %的乙醇, 浸取2 次,每次3 h , 葛根黄酮浸取效果, 此法较适合于工业生产。
(4)回流法
取原料置圆底烧瓶中, 加95 %乙醇回流1 h, 抽滤, 保留滤液, 药渣加95 %乙醇回流1 h, 抽滤, 滤液合并, 回收乙醇并浓缩成膏状, 后真空干燥得干浸膏。经试验得出结合实际需要的提取条件为加入18 倍量80 %乙醇回流提取3 次(分别8,6,4h), 提取5 h(2,2,1)。
(5)渗漉法
此法具体操作流程为:将原料加入渗漉桶, 加乙醇浸泡数小时, 再加乙醇进行渗漉, 将所得渗漉液提抽, 滤液回收乙醇并浓缩成稠膏状, 后真空干燥得干浸膏。结合生产实际, 提取工艺应用12倍于葛根量的75 %乙醇, 以2mL min的速度进行渗漉提取。此法于回流法提取率相近, 但由于回流法采用加热提取, 会带入较多杂质。
(6)有机溶剂萃取法结合酸水解的方法
将葛根以乙醇加热回流数次再将葛根乙醇提取物用乙酸乙酯萃取可使葛根中的脂溶性成分及异黄酮苷元进入乙酸乙酯, 而后再用正丁醇萃取,所得的正丁醇提取物主要为葛根中以黄酮苷类化合物, 这是由于葛根素为碳-碳糖苷化合物, 在酸性条件下难以水解, 因此正丁醇提取物水解后主要为葛根素和其他异黄酮苷元, 这样有利于葛根素的分离及产率的提高。工艺条件以60 %乙醇为溶剂,60 ℃温浸6 h, 采用逆流萃取法从葛根中提取葛根黄酮再用5 %盐酸水解1 h为佳, 水解后的酸性溶液中, 葛根素和大豆苷元以佯盐的形式存在, 通过过滤可以除去其他水不溶性杂质。本提取法操作简便, 产品纯度和产率高, 成本低。
(7)三价铁离子法
利用Fe3+能够和黄酮类化合物生成可溶性络合物的性质建立一种从中药中萃取黄酮类物质的新方法。具体流程如下:用甲醇冷浸原料组织提取粗提物, 进行水解、中和, 再加入FeCl3使黄酮物质与Fe3+络合溶解, 过滤除去其他不溶性物质, 用盐酸解聚Fe3+黄酮络合物, 得到黄酮粗品, 将其重结晶可得纯品。
(8) 超临界流体萃取法
该技术利用溶剂在临界点上所具有的特殊效应(气态和液态的双重优点)来选择分离混合物组分, 兼具传统溶剂萃取法和蒸馏法的双重功能, 尤其对热敏性物质和不挥发性物质的分离更具特色,此法在国外已广泛应用于天然植物的药用成分提取。

3.纯化

(1)大孔树脂分离法
此法主要操作规程如下, 取葛根粗分,用70 %乙醇回流提取, 过滤, 回收乙醇, 吸取浓缩液, 分别加到3个树脂柱上(经测试表明-D101大孔树脂对葛根素的吸附容量为60mg/g)(预处理以湿法装柱), 用蒸馏水洗至流出液色淡, 再用70 %乙醇洗脱至无葛根素, 洗脱液回收乙醇并蒸干, 用乙醇溶解, 定容, 进行含量测定。
(2)盐析纯化法
将葛根粗提物加入蒸馏水后加热煮沸, 冷却到室温过滤, 再将滤液中加入NaCl后搅拌溶解, 静置2 d析出白色沉淀, 在过滤出沉淀并用少量水洗涤,得葛根异黄酮纯品。
(3)铅盐沉淀法
此法原理为粗提异黄酮溶液中诸多微量杂质可以与醋酸铅形成沉淀, 而总异黄酮则与碱式醋酸铅形成沉淀, 从而达到除去杂质, 精制总异黄酮的目的。用此法得到的产品总异黄酮量高, 但出粉率极低, 这是因为铅盐在沉淀过程中, 将一些有效成分包络在一起沉淀下来, 使有效成分损失很大, 故此法不适宜于工业化生产, 但要得到较高纯度的葛根总异黄酮, 此法仍有一定的价值。

【分析方法】

1.定性分析

(1)紫外分光光度法
主要利用黄酮分子结构中羟基和芳环形成较强的共轭体系, 对紫外光((250±1)nm)有较强的特征吸收, 且性质稳定, 此法操作简便。
(2)薄层层析-比色法
用薄层层析分离葛根素, 利用黄酮分子结构中的酚羟基, 能与磷钨酸-磷钼酸试剂产生颜色反应, 在700 nm波长处有吸收的特性进行比色测定。
(3)络合-分光光度法
将样品用30 %乙醇溶解, 经NaNO3 、Al(NO3)3络合后, 在UV 510 nm处作紫外分光比色测定, 但因样品未经过分离纯化, 受杂质干扰, 定量测定误差较大。

2.定量检测

(1)高效液相色谱法(HPLC)
将样品溶解在有机溶剂中, 直接经高效液相色谱进行分离测定, 用归一法可测出总黄酮含量, 但设备要求严格, 操作较复杂。例如利用反向HPLC成功对银杏叶中6 种黄酮成分槲皮素、异鼠醇素、山柰酚、白果黄素、银杏黄素、西阿多黄素进行了分析。
(2)气相色谱法(GC)
将样品用衍生化试剂(如双三甲基硅烷基三氟乙酰氨)制成黄酮衍生物, 然后经气相色谱分离测定。
(3)超临界流体色谱法(SFC)
综合了气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)的特点的新分离技术。
(4)高效毛细管电泳法(HPCE 法)
该法简便快捷, 分析周期短, 消耗溶剂少, 费用低,抗污染能力强, 具有良好的精密度, 回收率和线性关
系, 适用于葛根及其制剂中葛根素的快速定量分析。
(5)导数脉冲极谱法
将原料用95 %乙醇回流提取2h , 取出放冷后称重, 补充失去的乙醇量, 摇匀, 加塞后放置澄清,上清液注入1%硫酸铵底液, 置极谱池中, 通氮气进行极谱测定。

【药理作用】

1.抗氧化及抗自由基作用
自由基性质活泼, 有极强的氧化反应能力, 对人体有很大的危害性, 在体内自由基和脂质过氧化作用使多种大分子成分, 如核酸、蛋白质产生氧化变性,DNA 交联和断裂, 导致细胞结构改变和功能破坏, 而引起癌症、衰老及心血管等退变性疾病。
生物体内常见的自由基有超氧自由基(·O-2)、羟自由基(·OH)、烷氧自由基(RO·)黄酮类化合物具有清除自由基和抗氧化的能力, 其作用机理在于它阻止了自由基在体内产生三个阶段:1)与·O-2 反应阻断自由基的引发;2)与金属离子鳌合阻断生成;3)与脂质过氧基(ROO.)反应阻断脂质过氧化过程。
2.对心血管系统的作用
(1)对血压的影响
黄酮类化合物对高血压引起的头痛、项强、头晕、耳鸣等症状有明显的疗效, 尤以缓解头痛、项强为显著。如葛根素对正常和高血压动物都有一定的降压作用, 静注葛根素能使正常麻醉犬的血压短暂而明显地降低, 也能显著降低清醒自发性高血压大鼠(SHR)血压。又如大豆黄酮能扩张冠状动脉及增加冠脉血流量, 有降低血压作用。
(2)抑制血小板凝集作用
黄酮类化合物对凝血因子具有较强的抑制作用, 故表现出较好的抗凝血作用。实验表明不同浓度的黄酮类化合物可以不同程度地抑制二磷酸腺苷(ADP)诱导的大鼠血小板凝集, 对5-羟色胺和ADP 联合诱导的家兔和绵羊血小板凝集也有同样的抑制作用。此外黄酮类化合物还可降低血管内皮细胞羟脯酸代谢, 使内壁的胶原或胶原纤维含量相对减少, 利于防止血小板粘附凝集和血栓形成,有利于防治动脉粥样硬化。
(3)对外周血管的影响
黄酮类化合物静注麻醉犬后, 全部动物的脑血流量增加且血管阻力相应降低, 还能使乙酰胆碱引起的脑内动脉扩张和去甲肾上腺素引起的收缩减弱, 使处于异常状态下的血管功能恢复正常水平。此外还可以改善异丙肾上腺素引起的小鼠微循环障碍, 使毛细血管前小动脉管径增加, 流速加快。
(4)抗心律失常作用
葛根素、大豆甙元和葛根醇提取物对乌头碱、氯化钡诱发的心律失常有明显对抗作用, 且醇提取物、大豆甙元的作用比葛根素强, 其作用机制可能是葛根成分影响细胞膜对钾、钠、钙离子的通透性而降低心肌兴奋性。
3.对平滑肌的作用
葛根含.有收缩和舒张平滑肌的成分, 特别是大豆甙元具有抗乙酰胆碱作用, 在临床多用于解痉。
4.抗癌及诱导癌细胞的分化作用
葛根中所含大豆甙元可抑制白血病细胞HL-60的增殖, 使细胞由原始的早幼粒阶段发育为趋向成熟的中幼粒、晚幼粒以及成熟的杆状粒、分叶核细胞。实验证明大豆甙元对HL-60细胞周期移行G1期阻断作用, 是HL-60 细胞分化的诱导剂。
5.对免疫功能的影响
葛根提取物在动物体内能激活腹腔巨噬细胞(PM)的吞噬功能, 可启动picibanil(OK432)或脂多糖在动物血清中产生肿瘤坏死因子。葛根制剂葛根汤可使主要吞噬碳粒的肝、脾脏的碳粒摄取能力增强。对免疫亢进的动物, 葛根汤可使其细胞性免疫功能反应性恢复。葛根汤使巨噬细胞的异物吞噬功能增强, 同时通过活化的巨噬细胞对细胞性免疫施以影响。
6.雌激素作用
黄酮类化合物具有雌激素的双重调节作用。当雌激素水平较低时, 表现为雌激素作用, 反之表现为抗雌激素作用。如大豆黄酮能提高大鼠、正常大鼠及未交配过的雌性正常大鼠乳腺的重量和乳腺细胞DNA 含量, 并能促进其乳腺发育和泌乳量。但同时也可使正常雄鼠的血清皋酮、雌二醇、生长激素等水平显著升高。
7.其他
此外葛根黄酮类化合物还具有降血糖、降血压、抗菌等多种作用。

【应用】

主要用于治疗心脑血管类疾病，如高血压、高血脂、偏头痛、冠心病、心肌梗塞、心绞痛、视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、突发性耳聋等症，同时广泛用于保健食品( 用于解酒、丰胸、延缓女性更年期、糖尿病引起的并发症等) 等领域。

【主要参考资料】

[1]任雪琴等.葛根黄酮的提取工艺及三波长—分光光度法测定其含量.武汉工业学院学报.2011.30(4):32-36.
[2]裴凌鹏等.葛根黄酮的提取和抗氧化研究.2003.17(3):78-82.