小鼠卵巢颗粒细胞的体外培养

背景及概述^[1]

卵巢颗粒细胞是动物生殖过程中非常重要的一类细胞。在动物体内，颗粒细胞的增殖分泌功能与卵母细胞的生长和成熟紧密相关，二者可形成功能上的整体。在体外条件下进行颗粒细胞增殖与分化的研究，可为妇女及雌性动物卵巢功能的检测、卵巢疾病引起的不孕症的治疗、避孕研究以及动物生殖毒理研究提供新的手段。到目前为止，对小鼠卵巢颗粒细胞体外培养的研究很少。有试验对小鼠卵巢颗粒细胞体外培养的生物学特性以及增殖调控因素进行了初步研究，以期为进一步阐明卵巢颗粒细胞在体内的作用及增殖、分化调节机制奠定基础。

体外培养^[1]

每只小鼠腹腔注射PMSG(8～10U)48h后，颈椎脱臼处死，无菌条件下迅速取出双侧卵巢，用PBS(-)清洗3次，在体视显微镜下去除其周围脂肪和被膜，用1mL注射器针头刺破卵泡使颗粒细胞和卵母细胞释放出来，加入1g/L透明质酸酶消化使颗粒细胞与卵母细胞分离，用孔径为0.074mm筛网过滤，1000r/min离心5min。弃上清，用PBS(-)清洗3次，加入基础培养液(D/F12培养基+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+0.5μg/mL两性霉素2B+体积分数10%FBS)重悬。

倒置相差显微镜观察结果表明，刚接种时颗粒细胞呈球形，10h后贴壁生长，培养24h后，形态不规则，呈多角形或梭形(图12A)。培养5d时可铺满皿底，形成单层的颗粒细胞(图12B)。部分颗粒细胞还出现聚集生长的特征，形成胚胎干细胞样集落(图12C)。

FSH、EGF和胰岛素对小鼠卵巢颗粒细胞的影响^[1]

用台盼蓝染色检测细胞存活率达70%以上时，调整细胞数，按照1×105mL-1接种，分别添加2μg/mL胰岛素、50ng/mLFSH、20ng/mLEGF，于37℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养。每间隔24h用胰蛋白酶对每组颗粒细胞进行消化计数。试验重复3次，数据结果用“平均数±标准差”表示，采用SPSS13.0统计软件进行分析。在细胞培养的第4天，与对照组相比，添加EGF或FSH对颗粒细胞具有显著的促增殖的作用(P<0.05)，而胰岛素促颗粒细胞增殖的作用不显著(P>0.05)。

干细胞特性^[1]

研究发现，部分小鼠卵巢颗粒细胞具有聚集生长特性，能形成胚胎干细胞样集落，这与体外培养的牛卵泡颗粒细胞的生长特性相似。为了进一步验证颗粒细胞集落是否具有干细胞表面特异性标记，选择了AKP染色和C2kit免疫组化染色对细胞进行了鉴定，结果显示两者均呈阳性，表明此类细胞可能具有干细胞特性。另外，卵巢颗粒细胞可用于核移植的现象本身也揭示颗粒细胞具有干细胞性质。因为分化程度低的细胞作为核供体更有利于重构胚的发育，利用哺乳动物体细胞作为核供体的成功率一般为0.4%～0.9%，而用小鼠卵巢颗粒细胞作为核供体时的成功率可达2.8%，不能排除这与部分颗粒细胞具有干细胞特性有关，但对于这方面的更深入鉴定尚待进一步研究证实。

相关研究^[2-4]

有实验观察右归丸水提液对卵巢颗粒细胞分泌雌激素、孕酮功能的影响。方法是首先运用体外培养技术进行小鼠卵巢颗粒细胞体外培养，采用直接给药法，观察右归丸水提液对小鼠卵巢颗粒细胞雌激素、孕酮的分泌量(放射免疫测定法)，并用检测卵巢颗粒细胞内cAMP水平(ELISA法)。结果显示右归丸水提液高剂量组(0.18g/ml)可明显增加颗粒细胞雌激素、孕酮分泌量，同时显著增加颗粒细胞内cAMP的浓度。因此右归丸温补肾阳的作用可能与直接促进颗粒细胞的分泌功能有关，同时，其作用途径可能是通过激活颗粒细胞内酰苷酸环化酶而实现。

此外，为探讨镉对雌性生殖机能的影响，有研究在幼鼠皮下注射孕马血清促性腺激素(PMSG)，48h后腹腔注射不同剂量的氯化镉，用琼脂糖凝胶电泳及TUNEL法对小鼠卵巢颗粒细胞进行凋亡检测；免疫组织化学法检测颗粒细胞的bax表达。结果显示注射氯化镉后48h的高、中、低剂量组小鼠卵巢颗粒细胞(GC)凋亡率分别为(13.8871±1.3299)%、(10.7573±1.2293)%、10.0208±0.9837)%，均显著高于对照组(0.6378±0.3872)%(P0.01)；96h对照组GC凋亡率显著升高，高剂量组与其它组间差异明显，中、低剂量组与对照组差异不明显。凝胶电泳仅96h高剂量组呈现梯状带。48h、96h各剂量组bax表达明显高于对照组(P0.01)。可见镉对卵巢颗粒细胞的凋亡有促进作用，并有一定的剂量相关性；TUNEL法检测细胞凋亡优于电泳法，当细胞凋亡率较低时(20%)，电泳检测不到DNA梯状带；小鼠卵巢颗粒细胞凋亡和bax的表达有一定的相关性，随凋亡率的升高bax表达呈上升趋势。

另外，还有实验研究邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）及其活性中间产物邻苯二甲酸单（2-乙基）己酯（MEHP）对卵巢颗粒细胞及其激素合成、分泌功能的影响。方法是体外培养健康初断乳ICR小鼠卵巢颗粒细胞，分别加入DEHP（10、50、250nmol/L），MEHP（10、50、250nmol/L）和溶剂对照（DMSO），作用细胞24h。用RT-PCR法测定原代小鼠颗粒细胞中类固醇激素合成急性调节蛋白（StAR）和P450侧链裂解酶（P450scc）mRNA水平；用Realtime-PCR法测定原代小鼠颗粒细胞中芳香化酶（CYP19）和过氧化物酶体增殖剂激活受体（PPARα、PPARβ、PPARγ）mRNA水平；用酶联免疫法（EIA）检测卵巢颗粒细胞上清液中雌二醇和孕酮的水平。结果显示与对照组比较，250nmol/LMEHP抑制StAR基因及P450scc基因表达（P均〈0.05）；250nmol/LDEHP对CYP19基因表达有促进作用（P〈0.05）；而10、50nmol/LDEHP及50、250nmol/LMEHP对CYP19基因表达均有抑制作用（P〈0.05）。除10nmol/LDEHP外，DEHP及MEHP其它浓度组均能抑制PPARα、PPARβ基因的表达（P〈0.05）；10nmol/LDEHP及MEHP对PPARγ基因表达有促进作用（P〈0.05），而250nmol/LMEHP对PPARγ基因表达有抑制作用（P〈0.05）。各剂量DEHP及MEHP均能使颗粒细胞分泌雌二醇增加（P〈0.05），10nmol/LDEHP、50及250nmol/LMEHP抑制颗粒细胞分泌孕酮（P〈0.05）。因此DEHP及MEHP影响小鼠卵巢颗粒细胞类固醇激素合成酶、PPARs的基因表达及分泌功能。

主要参考资料

[1]小鼠卵巢颗粒细胞的体外培养

[2] 右归丸水提液对小鼠卵巢颗粒细胞雌激素、孕酮分泌的影响及机制

[3] 镉对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响研究

[4] DEHP及MEHP对小鼠卵巢颗粒细胞分泌功能的影响