gRNA文库构建方法

概述^[1]

gRNA文库的建立将为重要基因功能的筛选、疾病机制研究及药物研发等方面提供新的动力，大大加快人类功能基因组研究计划的进展。

构建方法^[1]

CRISPR-Cas9系统是一种强大的基因组编辑工具，如风暴一般席卷了整个基因组工程领域。最近Andrea Ventura等人报道了这一系统在gRNA 文库构建方面的应用，而这样的应用往往需要同时表达一对gRNA，比如用Cas9切口酶进行大片段删除。CRISPR-Cas9是细菌在漫长的进化过程中演化出的重要防御机制。这个监控体系能够根据引导RNA（gRNA）的指示，靶标并降解入侵者的遗传物质。

现在，CRISPR-Cas9已经成为了炙手可热的基因组编辑工具，帮助世界各地的研究者们解决实际问题。近年来，这一技术在多个领域中展现了自己强大的实力，催生了大量的重要成果。人们发现，同时表达内切酶Cas9与gRNA，可以诱导真核细胞发生双链DNA断裂。在真核生物中，双链DNA断裂主要通过容易出错的非同源末端连接进行修复，会在目标位点形成小indel（插入缺失）。因此，CRISPR-Cas9系统是破坏基因编码框的一种简单途径。研究表明，CRIPSR-Cas9可以高效靶标多个基因，实现大规模的功能缺失筛选。

研究人员开发了一个快速制备配对gRNA文库的有效方法，大大拓展了CRIPSR在功能筛选方面的应用。该方法可以将寡核苷酸池中的一对gRNA克隆到任意CRISPR 表达载体上，还可以确保两个gRNA使用独立的启动子。研究显示，一个慢病毒载体上的两个gRNA不适合使用相同的启动子。研究人员为此构建了新型慢病毒载体，搭载一个人类U6启动子和一个经过改良的鼠类U6启动子。这项研究为人们提供了一个简单、快速又便宜的配对gRNA文库制备法，大大拓展了CRISPR技术在功能基因组学研究中的应用前景。

主要参考资料

[1] Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries