gRNA文库构建的流程

背景^[1-6]

gRNA文库构建基本原理是通过一段与靶标DNA相同的gRNA指导Cas9核酸酶对靶向基因进行DNA修饰，以此造成基因的功能突变或缺失。在此基础上，利用CRISPR/Cas9技术建立哺乳动物全基因组突变库或者与某类功能相关的基因突变体库，通过功能性筛选和富集以及随后的PCR扩增和深度测序分析，发掘与筛选表型相关的基因，称为CRISPR/Cas9 gRNA文库筛选。

gRNA文库是药物筛选或靶向筛选特定通路的理想工具，gRNA文库的建立将在功能基因筛选、疾病机制研究及药物研发等方面发挥重要的功能。gRNA文库包括：全基因组文库、lncRNA文库、信号通路、细胞凋亡、细胞增殖、离子通道、核受体相关、各种疾病相关等文库。全基因组gRNA文库的构建可以针对任何类型的基因组DNA，包括ORF cDNA，lncRNA cDNA以及特定区域的cDNA片段等。能够针对全长cDNA乃至基因组DNA构建高效的gRNA文库，适用于高通量功能基因及相关药物靶点筛选。

CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选大体流程分为五步，即gRNA文库选择，gRNA文库扩增，gRNA文库慢病毒包装，gRNA文库筛选，PCR扩增和NGS测序。

1、gRNA文库选择

首先客户选择所需gRNA文库。如果客户根据具体需要提出文库定制（小于300个基因），我们将根据客户提供的基因群信息进行单个基因的gRNA设计，保证每个基因设计3个不同的gRNA，程度确保基因功能的突变。采用的载体是单/双慢病毒载体，单慢病毒载体是一个载体上同时携带单个gRNA和cas9基因，双慢病毒载体是一个载体上只有单个gRNA，cas9蛋白则由单独携带cas9的载体提供。这两种模式载体均携带有额外的抗性筛选标记。

2、gRNA文库扩增

上述构建的载体数量较少，不足以进行文库的慢病毒包装和使用。因此，需要对上述载体进行扩增，增加总量。上述gRNA载体构建完成后，我们将这些载体按相同的比例混合成一个pool（即载体混合库），随后将载体混合库使用专用电转感受态，电转扩增培养并收集菌落，并进行扩大培养，最后抽提质粒，即得到了扩增后的载体混合库，也就是文库。

3、gRNA文库慢病毒包装

扩增后的gRNA文库在慢病毒包装载体的辅助下转染293T细胞，进行慢病毒的包装。由于gRNA文库是由多个不同的gRNA载体混合而成，因此获得的慢病毒是混合型病毒库，每个病毒携带单个gRNA载体。

4、gRNA文库筛选

对筛选的目的细胞进行病毒感染预实验，得到细胞在较低的MOI时感染百分数，以确认感染时gRNA文库的病毒用量。慢病毒库以较低的MOI值感染细胞（确保每个细胞最多进入一个慢病毒），随后根据实验目的而对细胞采用相应的处理，最后经过不同的筛选方式富集细胞。以耐药性基因筛选实验为例，根据前期药物IC50实验，得到药物筛选实验的处理浓度。采用高浓度药物处理感染后的细胞，经过筛选后存活的细胞则具有一定的耐药性，将此群细胞扩增并收集下来，耐药性的来源是CRlSPR/Cas9 gRNA对相应基因的修饰。

5、PCR扩增和NGS测序

对步骤4筛选中富集下来的细胞进行慢病毒载体的PCR扩增，该扩增片段包含载体所携带的gRNA序列，通过后续的NGS测序，可以得到富集细胞中gRNA的富集度，从而寻找到相应的基因，这些基因很有可能参与药物作用过程，因此可作为深入研究的待选基因。

应用^[7][8]

gRNA文库构建的流程可用于通路或疾病相关基因的筛选：

在利用CRISP/Cas9技术敲除C57BL/6小鼠中的RelB基因,为核因子(nuclear factor,NF)-κB转录因子蛋白家族的RelB基因与肿瘤转移等方面的研究提供RelB基因敲除实验动物模型。方法:利用基因编辑技术CRISPR/Cas9系统,设计并构建针对目的基因RelB第4外显子sgRNA,同时利用T7 RNA聚合酶体外转录Cas9 mRNA。取C57BL/6小鼠受精卵体外注射sgRNA和Cas9 mRNA后,进行胚胎移植,实现靶基因敲除。

待小鼠出生后提取DNA并进行PCR鉴定,获得F0代,后与野生型交配后繁殖,取样提取DNA,测序分析鉴定后获得F1代小鼠,并在蛋白质水平和基因组水平分别验证敲除效果。结果:获得了4个在RelB基因突变的首建鼠,并得到了稳定遗传的RelB基因敲除小鼠。基因组测序结果示,敲除实验组中RelB的mRNA出现无义突变,令其mRNA翻译终止。与对照组相比,敲除实验组检测不到RelB蛋白表达。同时,Western blot结果显示,NF-κB家族中其他成员RelA、p50和p52的蛋白表达不受影响。

参考文献

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[2]Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering[J].Patrick D.Hsu,Eric S.Lander,Feng Zhang.Cell.2014

[3]Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9‐mediated mouse genome targeting[J].Jiankui Zhou,Jianying Wang,Bin Shen,Li Chen,Yang Su,Jing Yang,Wensheng Zhang,Xuemei Tian,Xingxu Huang.FEBS J.2014(7)

[4]ZFN,TALEN,and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering[J].Thomas Gaj,Charles A.Gersbach,Carlos F.Barbas.Trends in Biotechnology.2013(7)

[5]Reporter Mouse Lines for Fluorescence Imaging[J].Takaya Abe,Toshihiko Fujimori.Develop.Growth Differ..2013(4)

[6]Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPRs):the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes[J].Sinan Al-Attar,Edze R.Westra,John van der Oost,Stan J.J.Brouns.Biological Chemistry.2011(4)

[7]The two NF-κB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity[J].Giuseppina Bonizzi,Michael Karin.Trends in Immunology.2004(6)

[8]徐帜,孙文博,张妍妍,许勇,唐金海.利用CRISPR/Cas9技术建立RelB敲除小鼠模型[J].南京医科大学学报(自然科学版),2019,39(03):313-319.