hepes缓冲液的应用

概述^[1]

hepes缓冲液的主要成分是羟乙基哌嗪乙硫磺酸（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid），HEPES是一种非离子两性缓冲液,其在pH 7.2 - 7.4 范围内具有较好的缓冲能力。其优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的PH值.在这种培养条件下,细胞培养瓶的盖子应拧紧,以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中。

大多数培养液中含有酚红作为pH指示剂,酸性培养液呈橙黄色,碱性培养液呈深红色.HEPES有些昂贵,在高浓度时对一些细胞可能有毒. 原则上,hepes缓冲液可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制.实际操作中并非如此简单。溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长也是很重要的。

hepes缓冲液使用方法有两种：

(1)hepes缓冲液可按所需的浓度直接加入到配制的培养液中,再过滤除菌.每1000ml培养液中加入2.38克HEPES,待溶后用lN NaOH 调pH至7.2,滤过除菌后使用.此时HEPES的使用浓度为10 mmol/L.

(2)亦可配成 100 x 贮存液（l mol/L），使用前取 99ml培养液加入 lml贮存液，最终应用浓度仍为10mmol/L。l mol/L（100 x）hepes缓冲液配制方法:取23.8g HEPES溶于90ml双蒸水中,用lN NaOH调pH至7.5一8.0,然后用水定容至100ml,过滤除菌,分装小瓶（2ml/瓶）,4℃或-20℃保存.

羟乙基哌嗪乙硫磺酸

应用^[3]

1.促进脱矿牙本质再矿化的方法，包括以下步骤：

（1）将133mmol/L NaCl溶液加入到50 mmol/L乳酸溶液中，直至乳酸溶液的pH值为4，得 到配置好的乳酸溶液；将2mm×2mm×12mm大小的EBPM-NACP树脂条放置于50mL配置好的乳 酸溶液中，共放置42天；其中于第7、14、21、28、35、42天分别测量该乳酸溶液中的Ca、P离子 浓度，得到其初次释放曲线，即图1-2；随后，树脂条再置于100mL上述配制的乳酸溶液中30 天，使其树脂条中的Ca、P离子彻底释放；

（2）将步骤（1）中得到的树脂条浸泡于5mL CaCl2和HEPES缓冲液构成的pH值为7的溶液 中，其中CaCl2终浓度为100mmol/L，HEPES终浓度为50mmol/L，震荡1min，用去离子水冲洗树 脂条并于空气中干燥；对EBPM-NACP树脂条进行钙离子“充电”；

（3）将步骤（2）中得到的树脂条浸泡于5mL K2HPO4和hepes缓冲液构成的pH值为7的溶 液中，其中K2HPO4终浓度为60mmol/L，HEPES终浓度为50mmol/L，震荡1min，用去离子水冲洗 树脂条并于空气中干燥；对EBPM-NACP树脂条进行磷离子“充电”；

（4）重复步骤（2）和（3）三次，将树脂条冲洗1min并在空气中干燥；

（5）将步骤（4）处理得到的树脂条放置脱矿牙本质样本上，并置于模拟口腔环境中。

进一步的，步骤（5）处理之前还包括以下步骤：将脱矿牙本质样本用浓度为1mg/mL 的端基为氨基的聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液浸泡处理1h；端基为氨基的聚酰胺-胺型树 枝状聚合物采用第三代端基为氨基的聚酰胺-胺型树枝状聚合物，简称PAMAM；常温、常压下 将10mgPAMAM粉末溶于10ml去离子水中得到1mg/mL的PAMAM溶液；第三代端基为氨基的聚酰 胺-胺型树枝状聚合物是以乙二胺为起始核心，反复与丙烯酸甲酯通过Michael加成反应后 再与乙二胺通过酰胺化反应制备而成的。

2.制备纳米金颗粒

步骤S1：配制浓度为0.05-10mmol/L的氯金酸溶液；

步骤S2：配制浓度为5-50mmol/L的hepes缓冲液，并用氢氧化钠调节hepes缓冲液的PH值至7.0-8.0；

步骤S3：向步骤S2所配制的HEPES缓冲液中添加表面活性剂，配制浓度为1-2mmol/L的表面活性剂溶液；

步骤S4：将步骤S3所配制的表面活性剂溶液引入反应池，按氯金酸溶液和表面活性剂溶液的摩尔比为1:1-1:10向反应池中缓慢添加步骤S1所配制的氯金酸溶液，并以200-300r/min的速度匀速搅拌，反应5-30min，获得含有纳米金胶体的混合液；

步骤S5：将步骤S4所配制的混合液进行纳米金胶体的干燥提纯，获得纳米金颗粒。

以配制200L的浓度为50mmol/L的hepes缓冲液为例，其配置方法为：首先称取2.38kg的HEPES溶于180L的去离子水中，超声、振荡直至完全溶解；然后使用PH计测得此时溶液的PH值约为5.4，于是慢慢添加0.1mol/L的氢氧化钠溶液并不断搅拌直至PH调整至7.4；最后继续添加去离子至200L。

制备 ^[2]

方法1:

直接使用1,2-二氯乙烷作为溶剂，在装有机械搅拌、温度计的100mL的三口瓶中加入羟乙基哌嗪（5.00g,0.02mol)，碳酸钾K2CO3（6.00g，0.04mol），50mL1,2-二氯乙烷，油浴加热90℃（1,2-二氯乙烷沸点85℃），搅拌反应20h。停反应，过滤，用200mL乙酸乙酯（EA）洗涤滤出的盐。滤液旋干，得2.6gHEPES固体。

方法二：

在装有磁力搅拌器、回流冷凝管的三口瓶中依次加入11.0g(84.5mmol)无水亚硫酸钠、27.0mL（343.6mmol)二氯乙烷、120mL水、110mL乙醇，50mg铜粉，搅拌，油浴加热升温到回流。回流22h后，将反应液减压蒸除水，至白色固体全部析出。此固体主要由产物、未反应的原料和生成的盐组成。将所得固体及500mL乙醇加入1L烧瓶中，加热回流40min。趁热抽滤，滤液冷却后，0℃放置过夜。抽滤，真空干燥，得片状结晶，产量11.40g，收率81.0％。

在装有磁力搅拌器、回流冷凝管、温度计的四口瓶中依次加入氯乙磺酸钠（15.10g，0.08mol），羟乙基哌嗪（9.88g，0.075mol），60mL水，油浴105℃搅拌反应，随着反应进行，反应液的pH会下降，滴加5mol/LNaOH水溶液，控制pH在9左右，共计加入15mL，再继续反应5h。

反应结束，将反应液加水稀释到500mL，上离子交换树脂柱（约500g）进行去盐纯化，反应液全部上柱之后，用蒸馏水冲至流出液pH为6，再用1mol/L氨水淋洗，收集TLC检测有产物点的流出液（pH约5~9）。旋蒸浓缩至150mL，加入活性炭脱色，油浴110℃，加热搅拌0.5h，过滤，旋干滤液，加入50mL乙醇，加热回流0.5h，热过滤，所得白色固体干燥后为8.63g。滤液滴加冰醋酸，调pH到5，0℃冷却过夜，过滤，所得固体干燥后为2.80g。与前述HEPES固体共计11.43g，收率64.5%。

10mmol/L hepes缓冲液配制方法如下：准确称取HEPES 2.383g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4℃保存。如果用于加入细胞培养液中作缓冲剂，建议培养液避光保存。

主要参考资料

[1] 曾琦斐. (2010). 表面活性剂存在下hepes缓冲溶液中制备纳米金颗粒. 武汉工程大学学报, 32(7), 39-42.

[2] 缪骥, 马锋, 刘学民, 向俊西, 董鼎辉, & 吕毅. (2015). 低渗hepes缓冲溶液对腹腔内游离肝癌细胞杀伤作用的实验研究. 中国普外基础与临床杂志(1), 55-59.

[3] Morgia F, Torti M, Montigiani M, M. Sbracia, & 朱亮. (2006). 卵母细胞单精子显微注射过程中使用含有羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)的缓冲液对体外受精的结局有害. 世界核心医学期刊文摘:妇产科学分册(11), 31-32.