4-羟乙基哌嗪乙磺酸的制备

背景及概述^[1][2]

4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)是一种重要的氢离子缓冲剂，其在pH为6.8～8.2的范围内具有良好的缓冲能力，能较长时间控制恒定的pH。使用浓度为10～50mmol/L，一般培养液内含20mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸即可具有良好的缓冲能力，且对细胞无毒性作用。

4-羟乙基哌嗪乙磺酸

应用^[3]

羟乙基哌嗪乙磺酸的其它应用也比较广泛。专利CN201310477071.6公开了一种利用4-羟乙基哌嗪乙磺酸作为模板剂制备了多孔氧化锌微球的方法。该法操作简单，所制备的微球尺寸均匀，具有多级孔结构等优点，可用于生产催化剂和气敏元件。专利CN201080052103.2将4-羟乙基哌嗪乙磺酸及其衍生物用于治疗癌症疼痛和抑制化疗后的副作用。
羟乙基哌嗪乙磺酸是动物源和人源细胞培养中的缓冲液常用组分。研究已经证实，4-羟乙基哌嗪乙磺酸在所有已知的缓冲液中具有最小的细胞毒性。FDA(美国食品和药物管理局)已经批准基于哌嗪的两性离子分子可作为食品添加剂。

具体应用：

4-羟乙基哌嗪乙磺酸对金枪鱼肽黄嘌呤氧化酶抑制剂的增强作用，具体实验步骤如下：

(1)在37℃条件下配制150mM，pH值7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、Tris-HCl、PB缓冲液，4℃保藏，待用；

(2)用上述150mM的缓冲液配制所需样品(金枪鱼肽)，样品浓度为40mg/ml；

(3)在96孔酶标板中依次加入50μL金枪鱼肽或50μL缓冲液(空白)、150μL黄嘌呤，每个样品做3个平行，37℃保温5min后加入50μL黄嘌呤氧化酶，30s读数一次吸光值，总计50次25min。读数完后以80μL的HCl终止反应，取反应液以相应缓冲液稀释10倍，过0.25μm水性膜，待测尿酸浓度；

(4)高效液相色谱法测定反应后样品中尿酸的含量，以尿酸标准品定量；

(5)计算黄嘌呤氧化酶抑制率，计算方法如下：

I＝(CB-CS)/CB×100％

式中：I表示黄嘌呤氧化酶抑制率，CB为空白组(不加多肽)反应后液相图谱尿酸峰的峰面积，CS表示样品组(加多肽)反应后液相图谱尿酸峰的峰面积。

本方法中金枪鱼肽制备工艺流程为：将金枪鱼鱼肉搅碎按料液质量比1：1加去离子水混合，调节pH值至7.0，按金枪鱼质量的0.6～1.2％分别加入复合蛋白酶和木瓜蛋白酶，在50～60℃条件下酶解4～7小时，酶解结束后升温至95℃保温15min灭酶，冷却后离心，取上清液浓缩后喷雾干燥即得金枪鱼肽。

在4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，Tris缓冲液和PB缓冲液中，黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤产生的尿酸含量几乎没有差异，而HEPES能够显著性地提高金枪鱼多肽的黄嘌呤氧化酶抑制率，这一结果表明4-羟乙基哌嗪乙磺酸可起到增强多肽黄嘌呤氧化酶抑制活性的作用。

制备^[2]

将0.5mol N-羟乙基哌嗪和0.525mol 2-羟乙基磺酸钠和500mL去离子水加入带回流管的1000mL四口烧瓶中，在充分搅拌下进行缩合反应；先在60℃下反应1.0小时，然后逐渐升温沸腾回流，并继续反应2.0小时；然后降温得到含4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠的反应母液。经高效液相色谱分析，计算得到4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠的产率为88.4％。

将含0.5mol 4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠，质量浓度为40wt％的反应母液置于1000mL烧杯中，在搅拌作用下，缓慢滴加46.5g浓盐酸(37wt％)，然后在常温下搅拌酸化1小时。然后向滤液中加入5g活性炭脱色。抽滤后的滤液用去离子水稀释到2wt％的浓度经纳滤透析除去氯化钠；最后经蒸发浓缩得到的4-羟乙基哌嗪乙磺酸粗品，最后用500ml无水甲醇洗涤三次，并经真空干燥得到高纯度4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

主要参考资料

[1] 崔洪友, 朱丽伟, 王建刚, 刘然升, 杨涌, & 王杨. (2017). 利用纳滤制备高纯度4羟乙基哌嗪乙磺酸的方法.

[2] 梁红波, 张伟, 吴涛, 沈江南, 张荣强, & 吴建平. (2016). 双极膜电渗析制备有机酸——以羟乙基哌嗪乙磺酸为实例. 过滤与分离(2), 8-11.

[3] 苏国万, 何伟炜, 赵谋明, & 孙东晓. (0). 4-羟乙基哌嗪乙磺酸在黄嘌呤氧化酶抑制肽中的应用.