一种生产7-氨基头孢烷酸的方法

背景技术

7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)是目前半合成头孢菌素的重要原料，主要由头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)通过化学法或酶法裂解脱去7-位上的D-α-氨基己二酰侧链得到。

酶法替代传统的化学法裂解头孢菌素C生产7-ACA，具有工艺简单、效率高、成本低、安全、无污染及产品质量稳定等优点，在经济和环保上都具有很大的竞争力。近些年来，人们已对酶法生产半合成抗生素的研究和开发投入了大量资金和力量。用酶法裂解生产7-ACA，分为一步酶法和两步酶法。其中一步酶法，利用头孢菌素C酰化酶(Cephalosporin C acylase)直接催化CPC，脱去7-位上的D-α-氨基己二酰侧链，生成7-ACA。虽然该法步骤简单，但目前已发现的CPC酰化酶活力都十分低，远不能满足工业催化的需要。两步酶法是利用两个来源不同的酶进行催化，首先，CPC在D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase，DAAO)的作用下，产生一个具酮基的中间体，这个中间体较不稳定，很容易被同时生产的H2O2化学氧化脱羧，转变成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(Glutaryl-7-amidocephalosporanic Acid，GL-7-ACA)；然后在GL-7-ACA酰化酶的作用下脱去其侧链，生成7-ACA。

目前，利用两步酶法催化裂解CPC制造7-ACA的技术在国外已经工业化，国内也已经引进国外技术进行7-ACA试生产，但是都采用固定化酶或固定化细胞的方式进行7-ACA的生产，目的是使酶能够反复使用。但这种方法具有一定的缺点，例如：在制备固定化酶之前需要对酶进行多步分离纯化，会造成酶的大量损失；固定化酶和固定化细胞都会增加底物和产物的扩散阻力，使催化反应速率下降；固定化酶和固定化细胞的酶活收率都较低，一般低于50％。在7-ACA生产领域，国内目前还没有自主生产的固定化酶，而进口的固定化酶价格昂贵，采用固定化酶生产的7-ACA成本甚至高于化学法的成本。因此，开发一条新的7-ACA生产工艺具有重要的经济意义。

在现代生物工程领域中，膜分离技术得到越来越多的关注。应用膜分离设备，可以将大分子物质(或细胞)和小分子物质进行很好的分离，而且作为催化剂的大分子物质(酶分子)和细胞的活性不会损失，可以进行反复使用。膜分离技术操作简单，成本较低，容易实现连续化操作。

随着中国加入WTO，国外先进技术生产的头孢菌素将大量涌入中国，国内抗生素工业将面临严峻的形势。因此，加紧开发具有先进水平的酶法生产7-ACA的技术，满足国内需求和增强国际市场竞争力已迫在眉睫。

发明内容

本发明所提供的生产7-氨基头孢烷酸的方法，包括以下步骤：1)培养并收集具有D-氨基酸氧化酶和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞；2)将步骤1)中收集得到的游离细胞重悬于pH7.0-8.0缓冲溶液中，然后加入1-5％的头孢菌素C溶液，在20-35℃反应200-600min，得到7-氨基头孢烷酸。

步骤1)中具有D-氨基酸氧化酶和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶活性的游离细胞可按培养出发细胞的条件进行培养条。

为了得到较高纯度的7-氨基头孢烷酸，上述方法中还包括分离和纯化步骤，所述分离纯化步骤为将上述步骤2)中得到的7-氨基头孢烷酸产物通过中空纤维滤膜，收集滤液，再将所述滤液的pH调至3.5，得到纯化的7-氨基头孢烷酸。

合成方法：

DAAO和GL-7-ACA酰化酶混合菌体的催化用LB培养基对DAAO的基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET-DAAO(三角酵母D-氨基酸氧化酶基因的EMBL genebank序列号为AY514426，基因扩增和质粒构建方法参见《分子克隆实验指南》，第二版，萨姆布鲁克T，科学出版社，1992。质粒图谱见2003年11月17日提出的申请号为200310113563.3的中国专利申请)进行培养和诱导表达，菌液在4℃下，6000r/min离心10min，离心收集菌体。将收获的菌体用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)在50mL三角瓶中重悬，菌浓度为OD600＝10。

用LB培养基对GL-7-ACA酰化酶的基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET-ACY(GL-7-ACA酰化酶基因的EMBL genebank序列号为AY311488，基因扩增方法见2003年6月9日提出的申请号为03143198.4的中国专利申请，质粒构建方法参见《分子克隆实验指南》，第二版，萨姆布鲁克T，科学出版社，1992。质粒图谱见2003年11月17日提出的申请号为200310113563.3的中国专利申请)进行培养和诱导表达，菌液在4℃下，6000r/min离心10min，离心收集菌体。将收获的菌体用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)在50mL三角瓶中重悬，菌浓度为OD600＝10。

将重悬的BL21(DE3)/pET-DAAO菌液和BL21(DE3)/pET-ACY菌液按相对酶活比为1∶1.5进行混合，再加入用同样磷酸盐缓冲液溶解的3％头孢菌素C溶液，28℃摇床反应。用HPLC法检测反应产物。采用Shimadzu C18柱，流动相为7.5％乙腈-15％甲醇-1％乙酸，流速为1mL/min，检测波长为260nm。结果如图2a所示，表明经过混合菌体约300min的催化反应，CPC基本都转化生成7-ACA，说明用游离的混合菌体细胞可以成功的催化CPC。