二氢嘧啶抗体的应用

背景^[1-3]

二氢嘧啶抗体是一类可以特异性结合二氢嘧啶的多克隆抗体，主要用于体外检测二氢嘧啶的免疫学实验。

二氢吡啶（diludine）的化学名称为2，6-二甲基-3，5-二乙酯基-l，4-二氢吡啶，是一种新型多功能的饲料添加剂，具有广泛的生物学功能，在医学上用作心血管疾病的防治保健药物，有治疗脂肪肝、中毒性肝炎、抗衰老、防早熟等作用。

实验室制法：可由乙酰乙酸乙酯和乌洛托品在醋酸铵的乙醇溶液中共热（1小时）制得；将所得液体冷却至析出结晶体后过滤并用乙醇洗涤，在空气中干燥可得淡黄色粉末状的二氢吡啶。

二氢嘧啶抗体

二氢嘧啶是农业部首次批准在我国使用的兽药类促生长添加剂，现列入农业部《兽药质量标准》2003年版中。二氢吡啶是一种具有天然抗氧化剂VE的某些作用的新型多功能添加剂，可抑制脂类化合物的过氧化过程，形成肝保护层；具有保护饲料中油脂及维生素VA、胡萝卜素不被氧化的抗氧化作用。同时，还可以改变血清中的某些激素水平，促进畜禽生长发育、提高繁殖性能及母畜的泌乳能力，并增强免疫功能，而且其代谢完全、几乎无残留。另外二氢吡啶能够显著地增强小肠的肌电活动，减缓小肠食糜后移，有利于小肠消化吸收，从而提高饲料利用率。

二氢吡啶适用于畜禽如猪、鸡、鸭、牛、羊，也适用于兔、蚕及水貂等。在饲料中的添加量：鸡、鸭0.015%，牛0.01%～0.015%或每千克体重4～6mg，羊0.01%、猪0.02%、长白兔0.025%、水貂0.1%。家蚕0.05%溶液。添加方法，先将本品与少量精料混匀，再逐渐扩大至与所有饲料混匀，可制成粉料或颗粒料，但应随制随喂，现拌现喂，这样可获得理想的效果。

应用^[4][5]

二氢嘧啶抗体用于新型二氢嘧啶类乙肝病毒抑制剂的设计、合成及活性评价

HBV感染性较强,主要通过无保护性行为、母婴、血液及破损的皮肤等途径传播,若无有效治疗则患者病情会进一步恶化肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）等恶性疾病。目前,已上市药物虽然能控制患者病情的进一步恶化,但现有药物仍无法治愈乙肝。因此,研发新型抗HBV药物具有重要意义。乙肝病毒的生命周期包括吸附、侵入、基因修补、转录、翻译、核衣壳装配、DNA复制、包膜形成和释放等步骤。其中核衣壳不仅作为HBV基因组的生成场所,更参与了分泌、包膜及成熟等重要生命周期。因此,以HBV核衣壳为新靶点进行药物设计具备合理性及可行性。目前多个HBV核衣壳的晶体-小分子配体已被解析出来,更有利于针对靶点的药物设计及研发。

而杂芳基二氢嘧啶（Hetero-aryldihydro-pyrimidines,HAPs）类HBV核衣壳蛋白装配调节剂无论是在活性、靶点及成药性方面的研究均较为透彻。其中GLS4活性较好,在HepG2.2.15细胞系中EC50为12nM,正由东阳光公司进行Ⅱ期临床研究。但是,GLS4的水溶性较差,其吗啉环在体内代谢不稳定（cLogP=4.7,t1/2=1.78 h）,限制了其临床应用。因此,需对GLS4进行结构优化以改善其性质。

为研发新一代HBV核衣壳蛋白抑制剂,针对HBV核衣壳蛋白中蛋白-溶剂界面处的丝氨酸残基,设计并合成了一系列共9个以硼酸为共价弹头的化合物并进行了生物活性评价,旨在提高HAPs活性的同时增加水溶性。所得终产物中P-8及P-9在HepG2.2.15细胞系中抑制HBV DNA的活性较好,EC50分别为0.4及0.38μM;但具有一定细胞毒性,CC50分别为32.5和29.2μM,选择性系数SI分别为81.37及77.63。分子模拟显示P-8的硼酸基团与核衣壳蛋白Ser141的羟基形成共价作用,这可能是保持抗病毒活性的原因,也初步验证了设计思路。

针对GLS4代谢稳定性差的问题,以二氢嘧啶类HBV核衣壳蛋白抑制剂构效关系为基础,采用基于晶体结构的分子杂合策略设计并合成了一系列酰胺类化合物并对其进行了生物活性评价,旨在提高HAPs活性的同时避免吗啉环的代谢不稳定性。活性结果表明,在10μM下Y-7及Y-9对HBsAg（99.1%;94.6%）及HBeAg（83.6%;82.1%）的分泌均具有很好的抑制活性,均大大超过先导化合物GLS4和上市药物拉米夫定（Lamivudine,3TC）。而苯环上取代基对活性影响很大,其中硝基取代的化合物（10μM下抑制率均大于40%）对HBV DNA的增殖抑制具有较好作用,其中Y-11活性较好EC50=1.24μM,但活性与先导GLS4（EC50=0.02μM）还有一定差距。综上,本论文基于二氢嘧啶类HBV核衣壳蛋白抑制剂的构效关系,设计合成了两类结构新颖的小分子化合物,并对其进行了体外生物活性评价及分子模拟对接实验。

首次将硼酸结构引入HAPs并用于核衣壳蛋白抑制剂的设计中,旨在研发创新性的共价结合型HBV核衣壳蛋白抑制剂,并取得了较好的活性结果（P-8:EC50=0.4μM;CC50=32.5μM）,发现了具有进一步研究价值的小分子抑制剂。同时,基于核衣壳的蛋白-溶剂界面修饰发现的二氢嘧啶-酰胺类化合物则进一步丰富了HAPs类核衣壳蛋白抑制剂的构效关系,为该类抑制剂的深入研究奠定了基础。

参考文献

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[5]张硕.新型二氢嘧啶类乙肝病毒抑制剂的设计、合成及活性评价[D].山东大学,2020.