小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体Α(PPAR-Α)ELISA KIT的应用

背景[1-3]

小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体Α(PPAR-Α)ELISA KIT用于测定人血清、血浆及相关液体样本过氧化物酶体增殖物激活受体Α(PPAR-Α)含量。

实验原理:本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中过氧化物酶体增殖物激活受体Α(PPAR-Α)水平。用纯化的过氧化物酶体增殖物激活受体Α(PPAR-Α)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入过氧化物酶体增殖物激活受体Α(PPAR-Α)，再与HRP标记的过氧化物酶体增殖物激活受体Α(PPAR-Α)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的过氧化物酶体增殖物激活受体Α(PPAR-Α)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中过氧化物酶体增殖物激活受体Α(PPAR-Α)浓度。

小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体Α(PPAR-Α)ELISA KIT

准备试剂与收集血样

1.收集标本：血清、血浆（EDTA、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。正常标本测定前用标本稀释液作1：1 0稀释（取2 0ul，加标本稀释液18 0ul,稀释1 0倍）。

2.标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成2 0 000U/ml的溶液。设标准管8管，管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在管中加入2000 0 U/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。

3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:1 0倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。

4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

检测程序

1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。

2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3.每孔中加入抗体工作液10 0ul。将反应板充分混匀后置37℃6 0分钟。

4.洗板：同前。

5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃3 0分钟。

6.洗板：同前。

7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。

8.每孔加入100ul终止液混匀。

9.30分钟内用酶标仪在45 0 nm处测吸光值。

结果计算与判断

1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2.以标准品20 00、100 0、500、250、125、62.5、31.2、0 U/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应OLab含量，再乘上稀释倍数1 0即可。

应用^[4][5]

用于过氧化物酶体增殖物激活受体α与2型糖尿病肾病的相关性研究

通过收集2型糖尿病肾病患者的血、尿标本,通过检测相关指标以探究PPARα与2型糖尿病肾病的相关性,以期探索糖尿病肾病治疗的新策略。

方法：随机选择70名2型糖尿病肾病患者为研究对象。收集患者的基础临床资料与实验室指标（如血常规、肝肾功、血脂、24小时尿蛋白）等,并用ELISA法测定血清PPARα、MDA、TGF-β的含量。

根据肾脏病饮食改良公式,估算GFR。按KDOQI指南提出的慢性肾脏病分期,将CKD1期、CKD2期患者为A组,CKD3期患者为B组,CKD4期、CKD5期患者为C组。比较三组患者临床及实验室指标的差异性,再使用相关性分析,分析PPARα与肾功能、氧化应激、炎症、肾纤维化的关系,以及Scr与各临床指标的相关性。

结果：1、A组、B组、C组三组组间NLR、RDW、UA、MDA、TGFβ有差异,差异有统计学意义（P值均＜0.05）。

2、A组、B组、C组三组组间PPARα无统计学意义（P＞0.05）。PPARα和MDA、TGFβ呈正相关（P值均＜0.05）,PPARα与BUN、Scr、eGFR、NLR、RDW、24小时尿蛋白无相关性（P＞0.05）。

3、UA和Scr、RDW、MDA、TGF-β、24小时尿蛋白呈正相关（P值均＜0.05）,与NLR无相关性（P值＞0.05）。

4、Scr和Neu、NLR、RDW、UA、MDA、TGF-β、24小时尿蛋白呈正相关（P值均＜0.05）,与Lym、RBC、HB呈负相关（P值均＜0.001）。

结论：1、2型糖尿病肾病患者NLR、RDW、UA、MDA、TGFβ随疾病进展而变化。

2、PPARα可能参与2型糖尿病肾病患者体内氧化应激及纤维化改变。

3、NLR、RDW是比较简便、快速、价廉的早期反应2型糖尿病肾病肾功能、炎症情况的指标。

4、UA可能是早期反应2型糖尿病肾病氧化应激、炎症、肾纤维化的指标之一。

参考文献

[1]Circulating betatrophin in relation to metabolic,inflammatory parameters,and oxidative stress in patients with type 2 diabetes mellitus[J].Alan Bapeer Hassan,Sherwan Ferman Salih,Israa Issa Hassan,Farsat Saeed Saadi,Deldar Morad Abdulah,Idris Haji Ahmed,Sherzad Majeed Taher,Bland Bayar Khaleel.Diabetes＆Metabolic Syndrome:Clinical Research.2019(1)

[2]Fenofibrate improves vascular endothelial function and contractility in diabetic mice[J].Nan Xu,Qin Wang,Shan Jiang,Qijing Wang,Weipeng Hu,Suhan Zhou,Liang Zhao,Lanyu Xie,Jianghua Chen,Anton Wellstein,En Yin Lai.Redox Biology.2019

[3]Definition of an oxidative stress status by combined assessment of Malondialdehyde and Oxidized-LDL:A study in patients with type2 diabetes and control[J].Zaniar Ghazizadeh,Pegah Khaloo,Hamid Alemi,Soghra Rabizadeh,Hossein Mirmiranpour,Alireza Esteghamati,Manouchehr Nakhjavani.Meta Gene.2018

[4]Thrombospondin-1 regulation of latent TGF-βactivation:A therapeutic target for fibrotic disease[J].Joanne E.Murphy-Ullrich,Mark J.Suto.Matrix Biology.2018

[5]李芮.过氧化物酶体增殖物激活受体α与2型糖尿病肾病的相关性研究[D].昆明医科大学,2020.