小鼠牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

小鼠牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中小鼠牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）的含量。

实验原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被小鼠牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

小鼠牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)ELISA试剂盒

样本要求：

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤:

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于PRRSV核衣壳蛋白在病毒转录过程中的作用研究

为建立N蛋白磷酸化位点鉴定方法,本研究利用Phos-tag技术成功实现了N蛋白磷酸化与非磷酸形式的分离。经Phos-tag SDS-PAGE凝胶电泳后,真核表达或者病毒本身的N蛋白能够出现2条特异性条带。运用免疫沉淀方法纯化和富集N-HA蛋白后,经牛小肠碱性磷酸酶（Calf intestinal alkaline phosphatase,CIP）处理后,N蛋白的磷酸化条带消失,说明N蛋白的磷酸化位点可能仅有1个。随后利用定点突变技术对N蛋白真核表达载体的丝氨酸位点进行单个突变或者利用基因合成方法将N蛋白的所有丝氨酸位点替换为丙氨酸作为阴性对照。

结果发现,Ser120突变后,N蛋白的磷酸化形式消失,与阴性对照一致。说明PRRSV N蛋白的磷酸化位点为蛋白C末端的第120位丝氨酸。为了进一步研究N蛋白磷酸化对于病毒复制的影响,本研究采用反向遗传学方法,对PRRSV感染性cDNA克隆进行N蛋白磷酸化位点突变并成功拯救了病毒。

结果发现,突变病毒在致细胞病变、空斑形态及N蛋白的亚细胞定位等均没有明显差异。而病毒的复制能力却稍微下降,多步生长曲线结果表明,在感染后的24-72 h,突变毒的复制水平比亲本毒低一个滴度左右。利用荧光定量方法检测亲本病毒与突变病毒在不同时间的基因组RNA和亚基因组RNA的转录水平,检测结果发现,在病毒感染的早期,突变毒的基因组RNA和长链亚基因组RNA的合成水平明显低于亲本毒,而突变毒的短链sgRNA却比亲本毒略高。这表明N蛋白的磷酸化对于病毒的感染性不是必需的,但是对病毒基因组RNA和亚基因组RNA的转录水平具有调控作用。PRRSV N蛋白不仅能够磷酸化,而且还能够与许多的宿主蛋白相互作用。

为了探究N蛋白与宿主蛋白相互作用对病毒复制和转录的影响,本研究通过免疫共沉淀实验发现,PRRSV N蛋白能够与宿主细胞的RNA解旋酶DDX5相互作用,并且主要的相互作用部位处于病毒复制的细胞质。进一步利用截短表达实验发现,DDX5与N蛋白之间的相互作用部位为N-N端连接,这种连接作用不需要RNA的介导作用,但是RNA的存在有利于两种蛋白的结合。

利用siRNA干扰方法发现,沉默宿主DDX5蛋白表达能够促进病毒的复制。进一步的研究发现,在病毒感染12 h后,病毒基因组RNA和长链亚基因组RNA的合成水平明显高于对照组,而短链亚基因组RNA没有明显区别。这一结果表明,DDX5在病毒复制过程具有负调控病毒长链RNA的转录过程。

参考文献

[1]The ATP-Dependent RNA Helicase DDX3X Modulates Herpes Simplex Virus 1 Gene Expression[J].Bita Khadivjam,Camille Stegen,Marc-Aure?le Hogue-Racine,Nabil El Bilali,Katinka Dohner,Beate Sodeik,Roger Lippe?e?.Journal of Virology.2017(8)

[2]Pathogenicity and antigenicity of a novel NADC30-like strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerged in China[J].Qiaoya Zhang,Ping Jiang,Zhongbao Song,Lin Lv,Liang Li,Juan Bai.Veterinary Microbiology.2016

[3]Protein Phosphorylation:A Major Switch Mechanism for Metabolic Regulation[J].Sean J.Humphrey,David E.James,Matthias Mann.Trends in Endocrinology＆Metabolism.2015(12)

[4]PRRSV structure,replication and recombination:Origin of phenotype and genotype diversity[J].Matthew A.Kappes,Kay S.Faaberg.Virology.2015

[5]刘欢.PRRSV核衣壳蛋白在病毒转录过程中的作用研究[D].中国农业科学院,2017.