渥曼青霉素的制备

发布日期:2022/6/17 10:47:50

背景及概述

渥曼青霉素，（Wortmannin，WT）是一种真菌代谢产物，为青霉菌产物，是磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）的特异性抑制剂。又名沃氏篮酶素；奥特曼宁。为浅黄色固体，熔沸点不高，主要用于医药中间体。动物科学中可用作PI3K/AKT通路的抑制剂，用于对该通路性质的研究。CAS号：19545-26-7，分子式：C23H24O8，分子量：428.4319，本品为浅黄色固体。本研究旨在通过HPLC法筛选产渥曼青霉素高效培养基，探寻治疗胰腺癌、胃癌、白血病、结肠癌和肝癌等的新途径。

图1 渥曼青霉素的结构式

制备

本文通过活化菌种、小型发酵、过滤、萃取、微孔滤膜过滤和高效液相色谱含量检测，筛选产渥曼青霉素产率最高的培养基[1]。

材料与方法

菌株lgt-4

从植物雷公藤根部分离得到经分子生物学手段鉴定为裸节菌属真菌Talaromyce［1］，于2014年9月12日分离并保存，菌种保存于4℃冰箱中。

培养基

豆芽汁培养基：黄豆芽100g和葡萄糖20g。红薯汁培养基：红薯100g和葡萄糖20g。萨氏培养基：蛋白胨10g和葡萄糖40g。山药培养基：山药100g和葡萄糖20g。PDB培养基：土豆100g和葡萄糖20g。马丁氏培养基：KH2PO40.4028g、MgSO40.1256g、蛋白胨1.2527g、葡萄糖4.009g和3000孟加拉红水25g。CYM培养基：麦芽糖10g、葡萄糖20g、酵母提取物2g、蛋白胨2g、无水MgSO40.244g和KH2PO40.46g，pH值7.0。麦氏培养基：葡萄糖0.404g、KCl0.72g、酵母膏1.021g、CH3COONa3.284g和蒸馏水400mL。大豆粉培养基：大豆粉2%、蔗糖2%、葡萄糖1%、KH2PO40.1%和MgSO40.01%。察氏培养基：NaNO33g、K2HPO41g、MgSO40.5g、KCl0.5g、FeSO420.01g和蔗糖30g。种子培养基：葡萄糖2.0%、蛋白胨0.5%、MgSO4·7H2O0.05%、酵母提取物0.2%、K2HPO40.1%和琼脂0.1%，灭菌前调节pH值6.0。玉米培养基：玉米仁100g。大米培养基：大米100g。生产培养基：蔗糖3.0%、可溶性淀粉3.0%、麦芽提取物1.0%、EBIOS0.3%、H3PO40.5%和MgSO4·7H2O0.05%，灭菌前调节pH值6.0。大麦培养基：大麦100g。豌豆培养基：豌豆37.480g。菌种保存培养基：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉5.0g、NaCl3.0g、Na2HPO42.0g和琼脂4.5g，pH值7.5。金氏B培养基：蛋白胨20.0g、K2HPO41.5g、MgSO41.5g和琼脂15.0g，pH值7.2。麦芽糖肉汤：蛋白胨5.0g、麦芽糖5.0g和牛肉浸膏3.0g，pH值7.0。改良MC培养基：大豆蛋白胨5.0g、牛肉浸膏5.0g、酵母粉5.0g、葡萄糖20.0g、乳糖20.0g、CaSO410.0g、琼脂15.0g和中性红0.05g，pH值6.0。营养肉汤（NB）：蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g和NaCl5.0g，pH值7.2。葡萄糖肉浸液肉汤：牛肉粉3.0g、NaCl5.0g、蛋白胨10.0g、K2HPO42.0g和葡萄糖10.0g，pH值7.5。普通肉汤培养基：蛋白胨20.0g、牛肉粉5.0g和NaCl5.0g，pH值7.5。肉浸液肉汤培养基：牛肉粉3.0g、NaCl5.0g、蛋白胨12.0g和K2HPO42.0g，pH值7.5。7.5%NaCl肉汤：牛肉粉3.0g、NaCl75.0g和蛋白胨10.0g，pH值7.5。硝酸盐氯化钾培养基基础：蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、K2HPO40.225g和KNO30.1g，pH值7.6。PAC培养基：蛋白胨5.0g、酵母膏2.5g、葡萄糖1.0g、NaCl10.0g和琼脂15.0g，pH值7.0。沙氏培养基：蛋白胨10.0g、葡萄糖40.0g和琼脂20.0g，pH值5.6。改良马丁培养基：蛋白胨5.0g、K2HPO41.0g、MgSO40.5g、酵母粉2.0g、葡萄糖20.0g和琼脂20.0g，pH值6.4。碱性蛋白胨水：蛋白胨10.0g和NaCl10.0g，pH值8.5。

试验方法

渥曼青霉素标准品溶液的制备

精确称取干燥恒质量后的渥曼青霉素标准品适量，用色谱甲醇配制成质量浓度5mg/mL的渥曼青霉素标准溶液，过0.22μm的微孔滤膜，4℃保存备用。

各培养基浸膏供试样品溶液的制备

分别精确称取干燥恒质量后的各培养基发酵浸膏适量，用色谱甲醇配制成质量浓度5mg/mL的各培养基浸膏样品，过0.22μm的微孔滤膜，4℃保存备用。

色谱条件

色谱柱:Kromasil100-5U C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相:水∶甲醇=36∶64，流速0.5mL/min，检测波长254nm，进样量10μL，温度30℃。

分析方法

原理：在一定浓度范围内，组分的浓度与所测的峰面积是呈线性关系的。

（1）峰面积的测量：色谱仪带有自动积分器和计算机控制的数据处理软件，能自动测量色谱峰的全部面积，对于不规则的峰也能给出准确的结果。

（2）定量计算方法：本试验采用的是单点校正法，即当被测试样中各组分浓度变化范围不大时，配制一个和待测组分含量十分接近的标准溶液，定量进样。此法假定标准曲线是通过坐标原点的直线，因此可用一点决定直线的斜率，从而绘出浓度对峰面积的标准曲线，进行样品分析时，在与标准样品严格相同的条件下定量进样，有所得峰面积在标准曲线上查出被测组分含量。

结果与讨论

检测波长的选择

加入配制好的对照品溶液，进行全波长扫描，在254nm处，渥曼青霉素有吸收，故选渥曼青霉素的仪器检测波长为254nm。

流动相的选择

通过试验对不同比例水-甲醇二元体系对样品的分离效果进行比较。为了避免样品中杂质的干扰，经反复试验，确定二者配比为36∶64，这时侯渥曼青霉素出峰时间短且峰型较好，与相邻峰的分离度R>1.5。

适用性试验

在上述选定的操作条件下，由手动进样器注入样品溶液，记录色谱图。试验结果表明：分离度=2.2>1.5，该色谱柱有较好的分离效能，分离程度可达99.7%，相邻两组分基本完全分离。由于峰型不对称或两组分有重叠时，峰宽很难测定，所以有时也可用半峰宽代替峰宽表示分离度。

标准曲线的绘制

渥曼青霉素在本试验设置的色谱条件下得到很好的分离。渥曼青霉素峰保留时间为37.845min。渥曼青霉素的线性范围分别为0.49～98.00μg/mL。回归方程：渥曼青霉素y=10^6X-22559，R2=0.9904。

Wortmannin含量的HPLC测定

按照已建立的样品测定方法，对各种样品的含量进行了测定，所得结果按下列公式计算样品浓度，总含量（g）=M×X×C1/（10×C2）式中：M为浸膏产量；X为由标准曲线计算得进样10μL中渥曼青霉素含量，μg；C1为标品的浓度，mg/mL；C2为样品的浓度，mg/mL；W为试样重量，g。红薯培养基，CYM培养基，大豆培养基，玉米培养基能代谢出较多量的渥曼青霉素，其产率为10%，其中豆芽培养基，产率最高为11.09%，为产渥曼青霉素含量最高的培养基。

结论

渥曼青霉素在临床上有广泛的应用，它对多种疾病都有治疗作用，目前有关生产方案基本都是化学合成，但产率较低且给环境保护会造成很大的压力。课题在前期研究发现，雷公藤中一株内生菌Talaromycesp.lgt-4能产生渥曼青霉素，但产率较低，为了提高该菌产渥曼青霉素的产率，所以本文就lgt-4产渥曼青霉素的培养基进行了筛选，希望能够得到高产渥曼青霉素的培养基。

本试验HPLC法测定产物含量的流动相选用甲醇-水最适合，测定渥曼青霉素吸收波长为254nm，且在30种培养基中，黄豆芽培养基和马铃薯葡萄糖培养基在产量和产率中都比较突出，且经济实惠，通过培养基筛选，得到了一种较优的培养基——豆芽培养基，其产渥曼青霉素的产率为11.09%，为以后有关此种植物内生真菌产渥曼青霉素的研究奠定了基础，并且为多种疾病的治疗开辟了新途径。