小鼠髓过氧化物酶(MPO)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

小鼠髓过氧化物酶(MPO)ELISA KIT采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗小鼠MPO单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的MPO与单抗结合，加入生物素化的抗小鼠MPO，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，MPO浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中MPO浓度。

小鼠髓过氧化物酶(MPO)ELISA KIT

准备试剂与收集血样

1.收集标本：血清、血浆（EDTA、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆、唾液、尿液等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。血清、血浆作1：1 0稀释（取2 0ul，加标本稀释液18 0ul,稀释1 0倍）。细胞培养上清可以不做稀释直接检测。

2.标准品液配制：使用前加入0.5ml蒸馏水混匀，配成200 0ng/ml的溶液。设标准管8管，管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在管中加入2 0 00 ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。

3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:1 0倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。

4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

检测程序

1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。

2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3.每孔中加入抗体工作液10 0ul。将反应板充分混匀后置37℃6 0分钟。

4.洗板：同前。

5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃3 0分钟。

6.洗板：同前。

7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。

8.每孔加入100ul终止液混匀。

9.30分钟内用酶标仪在45 0 nm处测吸光值。

结果计算与判断

1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2.以标准品200、10 0、50、25、12.5、6.25、3.12、0 ng/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应MPO含量，再乘上稀释倍数即可。

应用^[4][5]

用于小鼠癫痫持续状态后髓过氧化物酶对血脑屏障通透性和癫痫复发的影响研究

探究癫痫持续状态（Status epilepticus,SE）后血脑屏障（Blood-brain barrier,BBB）通透性变化的时间模式以及髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）对BBB和自发性复发性癫痫（Spontaneous recurrent seizures,SRS）的影响。

方法:选取雄性C57BL/6小鼠50只,随机分为癫痫组（n=45）和假诱导组（n=5）,其中癫痫组经腹腔注射匹罗卡品诱导SE后,根据观察时间节点的不同分为:0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和30 d六组;假诱导组腹腔注射同等剂量的生理盐水作为对照。采用水合氯醛麻醉后摘眼球取血法收集血清标本;采用心脏灌注后断头取脑法收集脑组织标本;采用酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测血清中S100β蛋白含量;采用免疫组化法检测脑组织中白蛋白的含量。血清中S100β蛋白含量和脑组织中白蛋白含量用于评估BBB的通透性,根据小鼠SE后不同时间节点蛋白含量的变化探究BBB通透性变化的时间模式。

2:选取雄性C57BL/6小鼠40只,随机分为4-氨基苯甲酰肼（4-aminobenzoic hydrazide,ABAH）组（n=15）、生理盐水组（n=15）和假诱导组（n=10）。ABAH组小鼠腹腔注射匹罗卡品诱导SE后2小时腹腔注射MPO特异性抑制剂ABAH（40mg/kg）,以后2次/日给药;生理盐水组在诱导SE后2小时腹腔注射同等剂量的生理盐水;假诱导组未使用匹罗卡品诱导SE的发生,余处理同生理盐水组。成功诱导SE 24小时后,选取诱导成功的生理盐水组、ABAH组和假诱导组小鼠各五只,采用水合氯醛麻醉后摘眼球取血法收集血清标本;采用心脏灌注后断头取脑法收集脑组织标本;采用酶联免疫法检测血清中S100β蛋白含量;采用免疫组化法检测脑组织中白蛋白的含量,评估ABAH对BBB通透性的影响。选取诱导成功的生理盐水组、ABAH组和假诱导组小鼠各五只,每日给药前1小时观察并记录小鼠癫痫首次发作的时间、每日发作的频率,评估MPO对癫痫复发的影响。

结果1.小鼠在腹腔注射匹罗卡品4.5±2.2min后即出现面部无意识运动、尾部僵硬、冷汗淋漓以及全身震颤等癫痫1-2级发作;20.4±8.2min后出现癫痫3级及以上发作,如双侧前肢的肌阵挛、后肢站立以及姿势失控、跳跃、跌倒等表现。本实验用于诱导SE的小鼠共计75只,其中25只小鼠抽搐剧烈死亡,成功诱导SE小鼠50只,诱导成功率为66.7%。假诱导组小鼠在整个实验过程中无任何癫痫样发作。

2.SE后,在不同时间节点测定小鼠血清中S100β蛋白含量发现:与假诱导组相比,SE后0小时癫痫小鼠血清中S100β蛋白含量即有明显升高（P=0.0022）。在SE后6 h、12 h、24 h小鼠血清中S100β蛋白含量均较假诱导组明显升高（P<0.001）。此后小鼠血清中S100β蛋白含量有下降趋势,SE后48h小鼠血清中S100β蛋白虽然较假诱导组有显著升高（P=0.0085）,但是较SE后24 h已有明显降低（P=0.0156）。SE后30 d,小鼠血清中S100β蛋白含量仍较假诱导组明显升高（P=0.0018）。

3.SE后,在不同时间节点取小鼠的脑组织标本,行免疫组化染色示:在SE后0 h,小鼠颞叶和海马组织内即有阳性表达的白蛋白,散在分布于细胞内和细胞外。SE后6 h、12 h和24 h,小鼠颞叶和海马组织内白蛋白的表达量明显升高且呈上升趋势。至SE后48 h,小鼠脑组织内白蛋白的表达较前有所减少,呈下降趋势。

参考文献

[1]Targeting crosstalk between Nuclear factor（erythroid-derived 2）-like 2 and Nuclear factor kappa beta pathway by Nrf2 activator dimethyl fumarate in epileptogenesis[J].Neha Singh,Sheekha Vijayanti,Lekha Saha.International Journal of Neuroscience.2018(10)

[2]P-Glycoprotein（ABCB1）Inhibits the Influx and Increases the Efflux of^sup 11^C-Metoclopramide Across the Blood–Brain Barrier:A PET Study on Nonhuman Primates[J].Solène Marie,Catriona Wimberley,Irène Buvat,Martin Bauer,Sébastien Goutal,Nicolas Tournier,Oliver Langer,Sylvain Auvity,Fabien Caillé.The Journal of Nuclear Medicine.2018(10)

[3]Nanoparticle-based delivery of carbamazepine:A promising approach for the treatment of refractory epilepsy[J].Anna Zybina,Anastasiya Anshakova,Julia Malinovskaya,Pavel Melnikov,Vladimir Baklaushev,Vladimir Chekhonin,Olga Maksimenko,Sergey Titov,Vadim Balabanyan,J?rg Kreuter,Svetlana Gelperina,Kenul Abbasova.International Journal of Pharmaceutics.2018(1-2)

[4]Breakdown of blood brain barrier as a mechanism of post-traumatic epilepsy[J].Aaron Dadas,Damir Janigro.Neurobiology of Disease.2018

[5]王泽青.小鼠癫痫持续状态后髓过氧化物酶对血脑屏障通透性和癫痫复发的影响[D].兰州大学,2019.