乳铁蛋白的应用

背景及概述^[1][2]

近几年，人们发现一些饮食中的蛋白质和肽在低浓度时具有特殊的生物活性，乳铁蛋白(Lf)就是其中一种。关于乳铁蛋白的第五次会议于上各国的科学家热烈讨论了关于乳铁蛋白性质、结构、体内外的表达、临床数据等方面的最新发现，每隔一年就有来自世界各地的大约多名科学家聚在一起讨论乳铁蛋白的这些最新发现。

乳铁蛋白具有抗菌、抗氧化、抗癌等多种生物活性，在婴儿配方食品、化妆品等产品中都有应用，目前关于乳铁蛋白生物角色的许多研究正在进行中。乳铁蛋白是一种铁结合蛋白，常见于黏膜分泌液中及中性粒细胞内。中性粒细胞的特异 颗粒中存在乳铁蛋白，表明其原始作用部位在细胞内。乳铁蛋白具有制菌作用，这与它掠夺细菌生长所需的铁离子有关，故此作用在双方铁离子结合部位都 饱和时即消失。

乳铁蛋白还具有在中性粒细胞脱颗粒 时改变细胞膜生化性质的作用，调节羟基的产生、颗粒的生成以及补体的功能。对人类来说，初乳是母亲产后提供给新生儿的份礼物，新生儿摄入后可提高免疫力，增强体质，但母乳毕竟有限，人类自然要寻找其他的初乳资源。综合考虑伦理、宗教、消费习惯以及工业基础等因素，人们转而开发牛初乳资源，它是迄今为止最为现实的初乳资源。

在功能食品研究中，可以研究通过向婴儿食品中添加从牛初乳中分离纯化获得的，功能性基料使之“母乳化”，使母乳化奶粉的研究上一个新台阶。生产乳铁蛋白的原料（初乳）廉价、丰富，在我国有生产利用乳铁蛋白的基础，而且色谱法和超滤法的更为广泛深入的研究，可望实现乳铁蛋白的工业化生产。它们可以用作食品和化妆品的天然防腐剂，也可作为新一代疗效性食品的功能组份，防治感染性疾病。因此，乳铁蛋白的开发利用具有重要意义和广阔的开发前景。

结构

理化性质^[3]

乳铁蛋白是一个大约有700个氨基酸残基构成的、分子量约为80000Da的单体糖蛋白，属于转铁蛋白家族。因其晶体呈红色，故也有学者称之为“红蛋白”。尽管有“乳铁蛋白”的称谓，它并非乳汁所特有，在哺乳动物的很多外分泌物中都存在，如：眼泪、唾液和精液等。只是除乳中外，其他分泌物中乳铁蛋白含量甚微。乳铁蛋白的抑菌效果与pH密切相关。

研究表明，在中性pH下具备较强活力。体系的pH为 7.4时，效果明显强于pH6.8时，而pH小于6时，则基本无抑菌作用。不同物种，甚至同一物种不同来源的乳铁蛋白分子之间，其理化性质可能有所差异。例如人乳和牛乳乳铁蛋白均能分离出表观分子质量不同的两个组分。此外，乳铁蛋白具有机体特异性，牛的乳铁蛋白不一定能被人体吸收，人体中的乳铁蛋白吸收利用与其体内的特殊受体有关。

生理功能及应用^[4]

乳铁蛋白具有独特而复杂的结构表现出了多种生物学功能，既可作为人体营养来源，补充铁和氨基酸，又可作为预防和治疗人类多种疾病的药物，用于维持肠道内菌群平衡，防止感染和抵抗病毒，抑制肿瘤发生与转移，阻碍体内产生自由基损伤机体等。

1. 参与铁代谢

铁是人体含量最丰富的必需微量元素，铁缺乏会导致贫血，影响我们的生活质量，如果人体内铁过量，会促进一些微生物的生长或产生自由基，对机体造成损伤，也会引起各种疾病。所以人体内铁代谢的调节十分重要。

乳铁蛋白结构中含有两个球状叶，每个叶包含一个铁结合位点，铁离子结合位点位于很深的裂缝中，能高亲和性地可逆的与铁结合，这就决定了乳铁蛋白参与铁代谢的功能，维持铁元素在一个较广的pH 值范围内完成在十二指肠细胞的吸收和利用。乳铁蛋白有很强的结合铁离子的能力，并且是唯一一种在很广泛的pH 范围内都可以结合铁离子的转铁蛋白。

乳铁蛋白在维持人体内铁离子正常水平起着非常重要的作用，具有结合并运输铁的功能：（1）能够增加铁的吸收率及利用率，降低铁的使用量并避免游离铁对肠道的直接刺激作用，因为乳铁蛋白的结合避免了铁离子对肠道的直接刺激，也减少了无机铁离子的摄入量；（2）可通过增强铜蓝蛋白活性，促进铁代谢，最终改善贫血症大鼠的相关症状；（3）乳铁蛋白还在调节铁代谢及在宿主黏膜表面对微生物感染有保护作用。综上，乳铁蛋白是一种有效的补铁制剂。

2. 广谱抗菌作用

乳铁蛋白是一种广谱抑菌剂，具有抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的能力。早期研究认为乳铁蛋白的抑菌功能在于其铁结合活性，因此可以夺取许多微生物生存所需的重要营养物质。一些研究表明乳铁蛋白在未结合铁离子时才有抗菌活性，并且抗菌活性随着与铁结合的饱和程度增高而逐渐下降。在很长的一段时期内乳铁蛋白的铁结合活性被认为是它唯一的抗菌机理。

后来发现乳铁蛋白对变异链球菌的抑制与其结合铁离子的能力无关。现在有研究表明乳铁蛋白的抗菌活性还与乳铁蛋白或来自乳铁蛋白的多肽与细菌物质的直接反应有关。乳铁蛋白能与脂质A 结合破坏细胞膜，改变膜的通透性，促使脂质A从革兰氏阴性菌的细胞壁上剥离出来，最终导致细菌死亡。除此之外，还可以与细菌其他部位非特异性结合使细细胞膜上的重要通道位点封闭，细菌分泌的毒性蛋白和其所需的营养物质的运输被阻断，细菌的代谢合成被抑制，最终导致细菌死亡。

所以，乳铁蛋白对微生物的抑制作用并非仅依赖于铁结合活性，还可通过直作用达到抑菌杀菌效果。并且在对牛乳铁蛋白的蛋白酶水解物的抗菌性进行研究后发现，水解得到的多肽具有强于完整乳铁蛋白20~400 倍的抗菌活性。将其命名为Lactoferricin B (LfcinB)，该多肽段为从N 端释放的一段阳离子型多肽，而该区域片段并无铁离子结合能力。

阳离子型抗菌肽LfcinB 更容易与细菌细胞膜表面带阴离子的脂多糖和磷脂部分相结合，达到选择性杀灭细菌的效果。1994 年发现，半胱氨酸蛋白酶抑制剂的活性部位与LF 的C 末端的17 个碱基序列有90%的同源性，且LF 对半胱氨酸蛋白酶具有与半胱氨酸蛋白酶抑制剂相似的抑制作用。

通过实验发现半胱氨酸蛋白酶抑制剂对金黄色葡萄球菌V8 的生长繁殖具有抑制作用，由此认为LF 的抗菌作用可能是通过抑制细菌的半胱氨酸蛋白酶而实现的。所以，乳铁蛋白的抗菌机理最新的认识是：乳铁蛋白的抑菌包括“铁剥夺”、“膜破坏”及“酶抑制”三种机理。

3. 抗病毒作用

除了抗细菌和真菌等广谱抗菌活性外，乳铁蛋白还可以抑制许多病毒，包括人体免疫缺陷性病毒（HIV）、RNA和DNA病毒，细胞巨化病毒、流感病毒等。近年研究表明，乳铁蛋白抑制病毒的作用通常在感染的初期发挥，防止病毒对宿主细胞的识别和侵入。关于乳铁蛋白抑制病毒的作用机制，至今尚无一致见解。目前主要存在以下几种理论：

（1）可能是蛋白结合病毒后影响了病毒与细胞结合，也可能是蛋白与细胞结合而阻止病毒与细胞结合。例如其对轮状病毒的抗性，乳铁蛋白与轮状病毒的结合是钝化了病毒和靶细胞受体结合的核衣壳蛋白。因此轮状病毒不再能够和粘多糖的肝素硫酸盐结合，从而阻止了病毒与宿主细胞的结合；

（2）通过促进T 细胞和B 细胞的成熟来调节机体的免疫反应，增强机体的防御能力；

（3）与病毒颗粒结合，防止病毒的血凝集作用，免疫组织化学表明乳铁蛋白还可以干扰抗原的合成，但作用机理目前还不明确；

（4)LF 能够抑制病毒(如脊髓灰质炎病毒和轮状病毒)在感染细胞后的复制，从而发挥抗病毒的作用；

（5）诱导机体分泌IFN-γ和IL-18等免疫因子，增强了细胞质对病毒的反应。

4. 影响自由基的生成

机体内氧自由基过剩，形成过氧化脂，损伤细胞和组织，是疾病或衰老的表现。通常只要有痕量的铜、铁等催化剂的存在，就会导致氧自由基的产生。游离铁离子和氧结合有很强催化自由基反应能力，正常情况下铁处于稳定大分子包围封闭状态中，一旦铁离子逃出这种封闭，与疏基结合便具有很强催化作用，在铁离子催化下可产生活性很强·OH 和其他氧化剂。

乳铁蛋白能结合Fe3+，阻断氧自由基生成。在适宜的pH 值条件下，乳铁蛋白结合及释放铁的特性具有选择性和可逆性。在病菌体内乳铁蛋白能促使机体产生氧自由基参与粒细胞对微生物的杀伤作用，而在一般细胞外pH 值条件下，乳铁蛋白通过激活单核细胞和铁结合的途径，抑制自由基的产生，从而保护嗜中性粒细胞免遭脂质过氧化作用，也阻止了自由基对组织的氧化损伤。

通过阻断自由基的产生，乳铁蛋白可降低自由基对动脉血管壁弹性蛋白的破坏，达到预防和治疗动脉粥样硬化和冠心病的目的。细胞内的一些重要酶发挥作用也必须依赖于乳铁蛋白与铁离子结合从而发挥出来的氧化还原活性。人和牛的LF 都已被发现有抑制脂质过氧化的作用，因此，LF用作食品和饲料添加剂可以起到抗氧化剂的作用。

5. 对肠道健康的影响

肠道是机体营养物质消化吸收的主要场所，也是机体抵御异物的道防线：一方面机体生长需要肠道以良好的通透性限度地利用并供给充足的营养物质，另一方面机体健康要求肠道以其紧密的结构形态限度地发挥屏障功能以阻止外源有害物质的入侵。有研究显示，乳铁蛋白在治疗极低出生体重儿的晚发败血症症和坏死性小肠结肠炎中具有较好的疗效和安全性；口服乳铁蛋白，可降低83%的结肠癌发病率。

乳铁蛋白对肠道健康有调节作用主要是因为乳铁蛋白具有多种生物活性：

（1）宿主防卫中抵御致病菌和促进有益菌的作用。在人体肠道内定植的细菌至少有500～1000 种，占人体总质量的1%～2%，许多肠道微生物对人类健康起到了重要作用，正情况下，肠道微生物之间以稳定的比例关系与宿主肠道相互依存又相互影响，形成动态的微生态平衡。肠道正常菌群与肠道免疫系统的形成和功能、肠上皮细胞的生长有密切关系，并可以阻挡病原微生物的入侵。乳铁蛋白可以抑制胃中的革兰氏细菌并促进双歧杆菌、乳酸菌增殖的作用，保护肠道不被有害细菌损伤；

（2）免疫调节和抗炎作用，如口服乳铁蛋白可刺激消化道上皮产生IL-18，发挥其免疫调节作用。可破坏肠道内的革兰氏阳性和革兰氏阴性致病菌，减少了它们对小肠上皮和粘膜的入侵；

（3）对小肠细胞生长的调节作用；

（4）调节体内铁离子水平的活性和酶活性等。增加肠道中铁的溶解性和吸收，降低过量铁导致的肠道损伤。在肠道疾病中，尤其以炎性疾病为主，检测粪乳铁蛋白（Fecal lactoferrin），将其作为一种疾病标志物来辅助诊断，结果表明其敏感度和特异性均较高。

6. 其他功能

乳铁蛋白还具有抗癌、基因调节、促进双歧杆菌的繁殖、调节骨髓细胞生成、抑制胆固醇积累、促进动物细胞生长，改善贫血症状促进伤口愈合和骨骼生长等功能。

分离纯化^[3]

目前主要有以下几种分离方法。

1）离子交换色谱法

最早使用DEAE纤维素阴离子交换树脂和磷酸纤维素交换色谱法分离出较纯的Lf成分，得到的Lf的纯度为81%左右。

2)亲合色谱法

亲合色谱是一种新兴的分离技术，通过该方法获得的产品纯度极高。由于其操作简单，分离效果好纯度高，且没有生物活性损失，是生产医药用高纯度，-最有效的方法之一。

3）固定化单系抗体法

载有单系抗体的免疫色谱是一种亲和力色谱法，它较成功的实现了Lf的一步分离。该方法的优点是分离效果好纯度高，抗体被固定可重复使用。其缺点是柱的制备工艺复杂，抗体成本昂贵，难以工业化生产。

4）超滤法

超滤法操作简便，费用相对低，易于形成工业化规模，但纯度不如色谱法高。

主要参考资料

[1] 内科学·第三卷

[2] 乳铁蛋白作为药物载体的研究进展

[3] 凌雪萍, 庞广昌, 李国强. 乳铁蛋白的最新研究进展[J]. 食品科学, 2003, 24(1): 160-163. [4] 陈车生, 袁勤生. 乳铁蛋白的研究进展[J]. 食品与药品, 2008, 10(1): 62-66.