亚细胞结构膜蛋白提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

亚细胞结构膜蛋白提取试剂盒通过在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。亚细胞结构膜蛋白提取试剂盒提供了一种简单、方便的从哺乳动物培养细胞或新鲜的哺乳动物组织中抽提胞浆蛋白和胞核蛋白的方法。抽提得到的蛋白为非变性型，有活性，可以用于后续操作。

亚细胞结构膜蛋白提取试剂盒

产品特点：

1.兼容性好，获得的样本适合于多种下游应用，包括免疫印迹、凝胶迁移分析、蛋白分析、报告基因分析以及酶活性分析。

2.可在90分钟内完成蛋白的提取。

3.操作简单，无需超速梯度离心。

4.一般情况下，胞浆蛋白与核蛋白之间的交叉污染在10%左右，基因组DNA/mRNA的干扰均降到了最低。

5.胞核蛋白一旦经过脱盐或稀释，即可用于免疫分析和蛋白相互作用实验，如迁移率分析(EMSA)、免疫共沉淀(Co-IP)和pull-down实验。

使用方法：

1.对于贴壁细胞:细胞刮刮下细胞，600g离心5分钟，尽量吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

2.对于悬浮细胞:600g离心5分钟，尽量吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

3.加入适量的预冷的PBS重悬细胞,600g离心5分钟，尽量吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

4.加入胞浆蛋白提取试剂A，振荡混匀数秒，使细胞完全悬浮并分散开，放置在冰上孵育10-15分钟。

5.加入胞浆蛋白提取试剂B,振荡混匀5秒，冰上孵育1分钟。(注意：若胞核蛋白中掺杂胞浆蛋白，可适当延长此步骤的孵育时间，一般可以延长1-5分钟。）

6.振荡混匀5秒，16000g离心5分钟。

7.立即吸取上清至一预冷的离心管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白，上清至于冰上保存用与后续实验或与-80℃保存，用于后续的分析。

8.加入胞核蛋白提取试剂，振荡混匀数秒，使沉淀完全悬浮并分散开，放回冰浴中孵育40分钟，期间每隔10分钟拿出来振荡混匀15秒，16000g离心5分钟。

9.立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白，将分离的胞核蛋白溶液至于冰上保存用与后续实验或与-80℃保存，用于后续的分析。

应用^[4][5]

用于牛支原体免疫相关膜蛋白及宿主细胞内与牛支原体感染相关蛋白的筛选和鉴定研究

筛选和鉴定牛支原体膜表面免疫原性蛋白及牛支原体感染相关蛋白,将为牛支原体致病机理和免疫机制的研究以及牛支原体相关疾病诊断方法的研发奠定基础。

研究内容:1.牛支原体武威株免疫相关膜蛋白免疫沉淀（IP）以培养至对数中后期的的牛支原体武威株全菌免疫新西兰白兔,制备全菌多克隆抗体;应用硫酸铵-辛酸法纯化抗血清中的IgG,并测定纯化后IgG的效价;提取牛支原体膜蛋白,定量后取适量膜蛋白加入一定量纯化的抗牛支原体全菌的IgG,在抗原抗体充分结合后,加入适量Protein A Sefinose,形成Protein A Sefinose-抗体-抗原复合物,充分洗涤除去未结合的的蛋白质后,将复合物进行质谱分析;结果显示,共筛选出158种具有免疫原性的牛支原体膜蛋白。

2. EBL细胞（EBL）膜蛋白与牛支原体膜蛋白免疫共沉淀（CO-IP）提取EBL细胞膜蛋白及培养至对数中后期的牛支原体膜蛋白,并将两者混匀,加入纯化后的牛支原体武威株全菌多抗IgG分子使其充分反应,形成抗体-抗原-互作蛋白复合物,进而将Protein A Sefinose与复合物结合,充分洗涤除去未结合的杂蛋白,所得产物应用液质串联质谱分析。结果显示,共筛选出40种可以与牛支原体膜蛋白发生互做的EBL细胞蛋白,其中细胞膜蛋白为18种,线粒体膜蛋白为11种,内质网膜蛋白为11种。

3. 牛支原体NOX1基因的克隆表达、酶学活性及其亚细胞定位研究以IP筛选的免疫相关膜蛋白NOX-1为目标蛋白,参照GenBank中Mb HuBei株NOX-1基因序列（GenBank登录号:NC015725.1）设计引物,应用PCR扩增Mb武威株的NOX-1基因,在完成测序后构建原核表达载体pET-NOX-1,并将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）,以异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物经纯化后进行酶活测定及多克隆抗体的制备,继而应用Western blot及间接ELISA对NOX-1在Mb内的分布进行了初步定位。

结果显示,Mb武威株NOX-1基因全长1 365 bp,且经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后,该重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达,且其分子量约为50 kDa;重组蛋白酶促活性最适酶促温度为30℃、pH为7.5,双倒数法求得重组蛋白Km和Vmax分别为256.41μmol/L、34.25μmol/（L·min）;Western blot及间接ELISA结果表明NOX-1在Mb细胞膜上和细胞浆中均有分布且胞浆含量较高。

参考文献

[1]Mycoplasma bovis-Induced Inhibition of Bovine Peripheral Blood Mononuclear Cell Proliferation Is Ameliorated after Blocking the Immune-Inhibitory Programmed Death 1 Receptor[J].Muhammad Suleman,Farhan S.Cyprian,Steve Jimbo,Teresia Maina,Tracy Prysliak,Claire Windeyer,Jose Perez-Casal.Infection and Immunity.2018(3)

[2]Induction of a balanced IgG1/IgG2 immune response to an experimental challenge with Mycoplasma bovis antigens following a vaccine composed of Emulsigen?,IDR peptide1002,and poly I:C[J].Tracy Prysliak,Teresia Maina,Lu Yu,Muhammad Suleman,Steve Jimbo,Jose Perez-Casal.Vaccine.2017(48)

[3]Virulence,persistence and dissemination of Mycoplasma bovis[J].Sibylle Bürki,Joachim Frey,Paola Pilo.Veterinary Microbiology.2015(1-2)

[4]Hydrogen Peroxide Production and Free Radical-mediated Cell Stress in Mycoplasma bovis Pneumonia[J].C.Schott,H.Cai,L.Parker,K.G.Bateman,J.L.Caswell.Journal of Comparative Pathology.2014(2-3)

[5]李丹.牛支原体免疫相关膜蛋白及宿主细胞内与牛支原体感染相关蛋白的筛选和鉴定[D].甘肃农业大学,2018.