小鼠神经细胞瘤与大鼠神经胶质瘤之融合细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠神经细胞瘤与大鼠神经胶质瘤之融合细胞（NG108-15细胞）是由小鼠N18TG2神经母细胞瘤细胞和大鼠C6-BU-1神经胶质瘤细胞在失活仙台病毒存在下融合而成。生长培养基：DMEM高糖(不含丙酮酸钠)＋HAT＋10%FBS＋1%P/S，培养条件气相：空气，95%；CO2，5%温度：37℃。

小鼠神经细胞瘤与大鼠神经胶质瘤之融合细胞

培养步骤：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于二苯乙烯苷对冈田酸诱导的NG108-15细胞Tau蛋白异常磷酸化的干预作用与机制研究

采用冈田酸诱导的NG108-15细胞制备阿尔兹海默病细胞模型,通过检测二苯乙烯苷对诱导的NG108-15细胞中磷酸化的Tau蛋白以及相关磷酸激酶和磷酸酶、磷酸激酶调控因子表达的影响,探讨二苯乙烯苷对阿尔兹海默病细胞模型Tau蛋白磷酸化调控的影响及作用机制。

方法:采用MTT法观察TSG作用于冈田酸诱导的NG108-15细胞24 h时的增殖情况,选取合适的剂量作为造模浓度。取对数生长期的NG108-15细胞,分为正常组、模型组、TSG低、中、高剂量（50、100、200μmol/L）组。利用AO/EB双荧光染色法检测TSG对细胞凋亡的影响;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测磷酸激酶蛋白CDK5、GSK3β、PKA、CK1、MAPK1、JNK,磷酸酶蛋白PP2A、PP2B、PP5和P35、Tau、P-Tau蛋白的表达。RT-PCR法检测CDK5、GSK3β、PP2A、PP2B mRNA的变化。

免疫荧光（Immunofluorescence）检测CDK5、GSK3β、PP2A、PP2B和Tau蛋白表达和分布。采用SPSS软件对正常组、模型组和高、中、低给药组的Tau、P-Tau蛋白,磷酸激酶CDK5、GSK3β、PKA、CK1、MAPK1、JNK蛋白、磷酸酶蛋白PP2A、PP2B、PP5和P35、Tau、P-Tau蛋白,磷酸激酶CDK5、GSK3β和磷酸酶蛋白PP2A、PP2B基因之间相关性进行分析。

结果:在MTT实验中,NG108-15细胞随OA浓度升高,存活率下降,当浓度为80nmol/L时,细胞存活率下降明显（P<0.01）,细胞衰老皱缩,细胞形态学发生改变,AO/BE荧光染色显示细胞有凋亡产生。

选取80nmol/L作为造模剂量,经给药后,TSG能够增强冈田酸诱导的NG108-15细胞的增殖能力,呈一定的剂量依赖;与模型组比较,TSG能抑制冈田酸对NG108-15细胞的衰老,提高细胞存活率（P<0.05）。

（1）TSG对OA诱导的NG108-15细胞Tau蛋白磷酸化的影响Western blot实验中显示,与正常组相比,模型组中P-Tau的含量显著升高（P<0.01）,TSG给药后与模型组相比,中、高剂量组P-Tau含量下降（P<0.01或P<0.05）,免疫荧光检测中,与模型组相比,TSG给药组能减少Tau蛋白的聚集。结果提示,TSG降低OA诱导的NG108-15细胞的Tau磷酸化水平,减少Tau蛋白的聚集程度。

（2）TSG对OA诱导的NG108-15细胞磷酸激酶的影响。Western blot实验中显示,与正常组相比,模型组中磷酸激酶CDK5、GSK3β、PKA、CK1、MAPK1、JNK蛋白的表达显著升高（P<0.01）,TSG给药后与模型组相比,给药组磷酸激酶CDK5、GSK3β、CK1、MAPK1、JNK、PKA表达降低（P<0.01或P<0.05）。RT-PCR结果显示,与正常对照组比较,模型组中CDK5和GSK3βmRNA的转录显著增多（P<0.05或P<0.01）,TSG能显著下调OA诱导的NG108-15细胞CDK5和GSK3βmRNA的转录（P<0.01）。免疫荧光检测中,与模型组相比,TSG给药组能减少CDK5和GSK3β蛋白的表达。结果提示,TSG能降低磷酸激酶CDK5、GSK3β、CK1、MAPK1、JNK、PKA的表达,从而减轻Tau的磷酸化水平。

参考文献

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[5]谭俊杰.二苯乙烯苷对冈田酸诱导的NG108-15细胞Tau蛋白异常磷酸化的干预作用与机制研究[D].广西中医药大学,2019.