碱性磷酸酶的检测方法

碱性磷酸酶(ALP)是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。

以ALP为目标物的检测方法有：

1 Gomori钙钴法

2偶氮偶联法

3碱性磷酸酶染色试剂盒法。

4.PNPP偶氮法

5. BCIP/NBT比色法

6 茜素红法

7. von Kossa法

1 Gomori钙钴法

【染色原理】

ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。

【孵育液配制】

3%β-甘油磷酸钠 5ml

2%巴比妥钠 5ml

蒸馏水 10ml

2% CaCl2 10ml

2% MgSO4 1ml

步骤

（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，待细胞长满玻片后取出。

（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。

（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。

（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。

（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。

结果

胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。

2 偶氮偶联法

【孵育液配制】 萘酚AS-BI磷酸盐 20mg

DMSO 0.5ml

0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2） 50ml

六偶氮副品红 0.5ml

1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。

（六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合）

【步骤】

（1）细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃ 10%甲醛固定10min。

（2）蒸馏水冲洗。

（3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。

（4）流水冲洗，晾干。

（5）甘油明胶封固。

【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。

3 碱性磷酸酶染色试剂盒法

【作用原理】 细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。

4.PNPP偶氮法

【步骤】

（1）用吸管吸掉96孔板内的培养液，用PBS冲洗3遍，加入含25mmol/L二乙醇胺，1mmol/L氯化镁和6.7mmol/L PNPP的反应液。

（2）每孔150ul.37℃避光放置半小时,然后加0.1mol/L氢氧化钠100ul终止反应,用酶标仪于405nm波长下测定OD值.

（3）样品OD值在ALP标准曲线上读取酶活性值(U/L).

ALP标准曲线绘制:

取PNP0.0111克用三蒸水溶解后稀释至250ml,此时PNP的浓度为320umol/L.依次稀释到160 umol/L，80umol/L,40umol/L,20umol/L,10umol/L和5mol/L.相当于ALP1280 U/L,640U/L,320U/L,160U/L,80U/L,40U/L和20U/L(活性值).用酶标仪于405nm波长下测定PNP的OD值.以ALP活性值作为自变量,对应的OD值作为应变量,求得直线回归方程.

【结果】测定碱性磷酸酶的含量

5.BCIP/NBT比色法

BCIP/NBT （四唑硝基蓝）是碱性磷酸酶底物, 产物为深蓝色, 在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP被水解, 水解产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。

【步骤】

1. 在膜或组织切片，最后一次洗涤完毕后，加入适量BCIP/NBT染色工作液

2. 室温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深度.

3. 用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应

4. 膜标本可干燥后避光保存；组织切片或细胞样品，显色反应终止后，可以用中性红复染染色

【结果】有不溶性的深蓝色物质出现

针对钙沉积物“钙结节”的染色方法

6. 茜素红法

【步骤】

（1）培养皿用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10min，双蒸水冲洗3次。

（2）0.1%茜素红-Tris-Hcl（PH 8.3）37℃，30min。

（3）蒸馏水冲洗，干燥，封片。

【结果】染料品种的不同，矿化结节呈现不同的红色。

7. von Kossa法

【步骤】

（1）培养皿用PBS冲洗2次，4％多聚甲醛固定5分钟，双蒸水冲洗3次。

（2）培养皿中加入5％硝酸银溶液1ml，将培养板开盖在紫外灯下照射1小时。

（3）倒出残留的硝酸银溶液，蒸馏水冲洗3遍。

（4）培养皿中加入5％硫代硫酸钠溶液1ml，中和残留的硝酸银溶液，吸出残液。

（5）室温下晾干，封固。

【结果】钙结节呈现清晰可见的黑颜色。