血红蛋白的制备方法

背景及概述^[1]

血红蛋白是血红细胞中的最主要蛋白成分，同时也是血液的主要蛋白成分，在红细胞中还含有微量的超氧化物歧化酶(S0D)、碳酸酐酶、糖酵解酶系等，在血浆部分则含有200多种功能不同的蛋白组分，有的属多酶系统如补体系统、凝血系统、纤溶系统和激肽原系统等，有的属免疫球蛋白类、蛋白酶抑制物、转输蛋白类、类脂蛋白类等。

制备^[1-3]

报道一、

S1、血液的选取：首先从医院或医疗机构收取过期人血，然后通过称量设备量取所需体积的过期人血，备用；

S2、血浆的去除：将步骤S1量取的过期人血倒入离心设备中，然后以转速为450r/min，温度为28℃的条件下旋转离心15min，之后沉淀35min，即可完成将过期人血中的红细胞分离出来，然后采用缓冲液系统将分离出来的红细胞洗涤2次，洗涤液常用等红细胞体积的等渗溶液如生理盐水，该洗涤过程也同时除去来白细胞和血小板，能够去除血浆蛋白和部分膜磷脂，缓冲液系统为125mM的NaCl、13mM的葡萄糖、2.5mM的MgCl2、54mM的KH2PO4和19mM的K2HPO4组成的缓冲溶液，使用该缓冲液系统进行洗涤，能够防止红细胞的破裂和维持稳定的胞内环境；

S3、血红蛋白的释放：经过步骤S2得到堆积的血红细胞后，先把红细胞置于肾透析仪中，再倒入低渗溶液中透析1.5h，使红细胞逐断膨胀以至膜破裂，然后再将透析后的混合溶液转移至0,lμm的超滤制备中，从而过滤出血红蛋白溶液，其中基本上不含有任何脂类，通过低渗溶液来溶胀红细胞，使部分膜孔打开以释放血红蛋白，限度地释放血红蛋白而又较完整地保存了细胞膜的结构，低渗溶液为2.5mM的MgCh、6mM的K2HPO4和2.4mM的KH2PO4组成的混合溶液，肾透析仪选自型号为BC2600的全自动血细胞透析仪；

S4、基质的除去：将步骤S3得到的血红蛋白溶液转移至离心设备内，在25000g的离心力下，离心时间为80min，除去红细胞膜及膜碎片基质，然后分类上清液，将所得的上清液依次过0.45和0.2pm滤膜以进一步除去更小的基质和病菌，之后使用pH调节剂调节pH和盐离子浓度，所得的上清液是含有微量杂蛋白和脂类的血红蛋白溶液，pH调节剂为1mol/L的碳酸钠溶液；

S5、血红蛋白的纯化：用100kd的滤膜或病毒滤器过滤，以起到脱磷脂或病毒的作用，再通过凝胶排阻层析柱对血红蛋白溶液进行分离，即可得到血红蛋白纯品，血红蛋白的纯化可除去99.7％以上的磷脂和99,9％以上的血型抗原，凝胶排阻层析柱为WatersQMA-Acell柱，该层析柱一次能够得到21g血红蛋白，且需时仅为1h。

报道二、

取新鲜抗凝牛血，用0.9％NaCl洗涤血液三次，用冷水溶解红细胞。在4℃条件下，离心30分钟，去除细胞碎片和未溶解的细胞，上清液即为待纯化的血红蛋白溶液；向待纯化的血红蛋白溶液中加入填充剂Na2SO4，按100ml待纯血红蛋白溶液加入2.85g填充剂Na2SO4，得到待纯化血红蛋白样品；上样前，用平衡液0.2M Na2SO4/25mM Tris-HCl平衡亲和层析色谱的介质，亲和层析所用介质为CM Sephadex-Sulfanilamide，然后将制备好的待纯化血红蛋白样品上样，直至与介质层面齐平,得到流穿液，即为纯化的血红蛋白。

报道三、

整个过程在2～6℃条件下进行：

1、将加入了抗凝剂如肝素的猪动脉血离心去除血浆、白细胞、血小板，用生理盐水洗涤红细胞2～4次，低速离心后得到压积红细胞；

2、用2～8倍压积红细胞体积的低渗溶液如0.01M NaCl或低渗PBS溶解压积红细胞，通入氮气或氩气等惰性气体，在溶血液中加入pH值为7.0～7.4的维生素C至溶液pH值达到7.0～7.4，再加入保护剂如葡萄糖至终浓度为1～5％，加入青霉素和链霉素等常规抑菌药物，充分搅拌1～4小时，高速离心10～30分钟后得到粗制血红蛋白溶液；

3、往粗制血红蛋白溶液中加入体积是粗制血红蛋白溶液1/10～1/4的甲苯，震荡摇匀后低温条件下萃取2～6小时，取下层血红蛋白溶液进行透析；

4、将血红蛋白溶液装入透析袋中，在加有抗氧化保护和抑菌药物的透析液中透析36～72小时，中间更换1～3次透析液，去除残留甲苯和小分子物质；

5、将透析后的血红蛋白溶液加入适量保护剂冷冻真空干燥成干粉后，溶解成高浓度、小体积的液体，上样于葡聚糖凝胶层析柱纯化，收取分子量均一的高纯度血红蛋白；

6、经0.22μm滤膜过滤除菌去热原，然后冷冻干燥成高纯度无基质无热源的血红蛋白干粉保存于2～8℃。

应用^[4]

高密度发酵技术一直是工业生产中要求的高效技术。对于很多需氧微生物，在发酵过程中限制细胞密度的最为重要的因素是氧气的利用。因此需要开发出了多种针对提高需氧微生物氧气利用率的技术。

CN201510845454.3提供了一种利用血红蛋白提高发酵细胞密度的方法。本发明提供了一种提高微生物发酵细胞密度的方法，通过在细胞周质空间表达血红蛋白和/或细胞表面展示(surfacedisplay)血红蛋白，和/或重塑细胞外膜的方法，促进血红蛋白与氧气的接触，从而提高氧气的利用效率，实现提高微生物发酵密度。实验证明，本发明构建的工程菌可以提高微生物发酵细胞密度以及胞内积累产物PHB的含量。