血红蛋白的检测方法

概述^[1]

血红蛋白，作为一种血液替代物，具有渗透活性和运输和传递氧的能力，但它具有通过肾路线和经过血管壁的循环中迅速消除的缺点，导致一种很短的，因此，典型地不令人满意的半衰期。进一步地，人血红蛋白也常常被有毒水平的内毒素、细菌或病毒污染。

天然血红蛋白通常在红细胞内主要起携氧释氧作用，供给机体氧气的需要。血红蛋白分子量为64.5KD，内含四个亚基，两个α亚基，两个β亚基。Hb中每个亚基由肽链和一个血红素(heme)分子组成，每个heme分子上有一个二价铁。含二价铁的血红蛋白称为亚铁血红蛋白，具有携氧释氧作用；其中结合氧的亚铁血红蛋白称为氧合血红蛋白(O2Hb)，未结合氧的亚铁血红蛋白称为脱氧血红蛋白(HHb)。亚铁血红蛋白容易被转变成其他形式的血红蛋白，如被氧化后形成高铁血红蛋白(metHb)(二价铁被氧化成三价铁的血红蛋白)、与CO结合形成碳氧血红蛋白(COHb)、与硫化物结合形成硫化血红蛋白(SHb)等等。未强调是哪种血红蛋白类型的，通常都是指氧合血红蛋白。

血红蛋白氧载体主要目的是克服血红蛋白本身的肾毒性，代替红细胞携氧释氧的功能。目前主要应用于急性失血病人的紧急救治或是在红细胞不可获得的情况下代替红细胞使用，使用剂量都较大，需要通过静脉给药。

血红蛋白灭活病毒^[2]

步骤1：在一可密闭容器中加入10mg/mL的猪血红蛋白80mL，再加入10ml猪伪狂犬病毒（PRV），搅拌，在溶液上方通入氮气，再将蛋白溶液用气体交换膜进行脱氧处理，液相一侧接溶液，气相一侧通入氮气，将亚铁血红蛋白转化成脱氧血红蛋白，待转化率大于95%并且溶液中的氧分压低于2mmHg时进行步骤2；

步骤2：加入10mL10%连二亚硫酸钠，使其终浓度达到1%，反应1.5h，去除残余的氧；

步骤3：逐滴加入0.5mol/L盐酸，使溶液pH逐渐降低至4.0左右，停止通入氮气，密封容器，阻止容器内部与大气交换；

步骤4：在15℃条件下，搅拌21天；

步骤5：逐滴加入0.5mol/L氢氧化钠，使溶液pH升至7.5，打开容器；

步骤6：以氯化钠为透析液，充分透析上述溶液，收集得到的蛋白溶液即为灭活病毒后的蛋白溶液。

检测方法^[3]

血红蛋白的检测方法包括：硫酸铜滴定法进行血红蛋白测定，或者采用进口大型生化分析仪进行测定。前者存在自行配制误差大、易受环境温度影响等缺点,后者仪器价格昂贵,测试成本高。国外常用的测试方法为试剂盒和干式生化分析法,试剂盒法需要大型生化分析仪,干式生化分析法产品主要有德国的Re-flotronⅣ型全血干式生化分析仪和瑞典的SWELAB血液分析仪,采用的均是波长比色法,所需采血量较大,测试时间长,成本高。

免疫层析胶体金技术的优点是微创取样，取样量少，成本低，检测快，准确度高，适用于现场及家庭检测，而目前市场上未出现免疫层析技术检测血红蛋白含量的产品，其技术难点在于血红蛋白双抗体夹心存在HOOK效应，因此目前免疫层析双抗体技术还是主要集中在潜血，隐血的检测项目中。

Hook效应是指在双位点夹心免疫试验中，其剂量反应曲线的高剂量区段，线性走向不是呈平台状无限后延，而是向下弯曲状，此现象称之为HOOK效应。目前对于血红蛋白的免疫学检测，一般需要多步稀释才能使其处于线性范围内，但这样造成的误差势必会加大。

主要参考资料

[1] 周翔海, & 纪立农. (2005). 空腹血糖和糖化血红蛋白用于筛查糖尿病的研究. 中国糖尿病杂志, 13(3), 203-205.

[2] 黄应平, 蔡汝秀, HuangYingping, & CAIRuXiu. (2001). 血红蛋白作为过氧化物模拟酶催化显色体系的研究与应用. 分析化学, 49(4), 378-382.

[3] 王全林, 刘志洪, 蔡汝秀, & 吕功煊. (2003). 血红蛋白的过氧化物酶催化特性研究. 化学学报, 61(1), 34-39.