L-赖氨酸的制备方法

背景及概述^[1]

L‑赖氨酸是人体必须氨基酸，是合成核蛋白、血红蛋白及合成脂肪酸代谢的重要载体‑肉毒碱的重要成份，还是促进大脑神经细胞再生的重要氨基酸，赖氨酸可增加胃蛋白酶及胃酸分泌，因此能促进老人及儿童的食欲。赖氨酸对营养不良、乙型肝炎、支气管炎等有一定的辅助疗效。赖氨酸与铁化合物一起，治疗贫血效果显著。

制备^[1-3]

报道一、

(1)向L‑赖氨酸盐酸盐中加入纯化水(去离子水)，L‑赖氨酸盐酸盐与纯化水的重量比为1∶1，混合均匀并完全溶解，放置待用；

(2)上柱吸附

将步骤(1)所得的溶解液按13L/分钟的流速，加入装有阳离子交换树脂的离子交换柱内，至树脂阳离子交换树脂全部吸附赖氨酸、且柱子的排出液内不含有赖氨酸，然后用纯化水通过交换柱内的树脂进行洗涤，洗至柱子的流出液中无Cl‑(此时流出液的pH为7)；

(3)洗脱

然后用2mol/L的NH4OH(氨水)把L‑赖氨酸洗脱下来，NH4OH以13L/分钟的流速流经离子交换柱，当离子交换柱的流出液pH值上升至8.0时，流出液开始有茚三酮反应即L‑赖氨酸开始流出，收集流出液；当离子交换柱的流出液pH值上升至9.0～12时茚三酮反应颜色深，此时L‑赖氨酸含量高，洗脱至流出液无茚三酮反应即可停止收集；

(4)减压浓缩

将收集液在0.2Mpa、60～62℃减压浓缩赶氨，浓缩至原收集液体积的1/3时、加入此时浓缩液重量3.5％的活性炭进行脱色、过滤，冷却结晶，即得L‑赖氨酸。

采用电位滴定仪检测并计算的产物纯度为98.5％。

报道二、

游离L-赖氨酸固体的制备：称取1.00kgL-赖氨酸盐酸盐加入到5.0L纯化水中搅拌溶解澄清，然后将溶液加入到7.20kg活化后的强酸性阳离子交换树脂柱上，缓慢冲洗树脂柱，2-3h冲洗完，再继续用纯化水冲洗至中性和无氯离子(0.1mol/L硝酸银监测和广泛pH试纸)为止。用11.1kg5％v/v的氨水加入到树脂柱上，缓慢冲洗树脂柱2-3h左右，冲洗过程检测pH值大于10时，开始收集碱性洗脱液，直到pH值减小到10左右停止收集。将收集到的溶液在60℃(-0.10～-0.08Mpa)减压浓缩，浓缩出水和氨气，直到无液滴滴出，继续浓缩变成白色固体，向体系中加入8L的无水乙醇，继续打浆析晶，打浆3h，析出所有固体，离心过滤出固体，直到无液滴滴出，将滤饼平铺到搪瓷托盘，真空干燥(60±5℃，-0.08～-0.1Mpa)8h，将产品冷却室温，装入密封袋密封阴凉处保存，得到游离L-赖氨酸固体776g，收率96.95％，纯度：99.62％，HNMR(D2O):3.223-3.188(CHN)、2.848-2.794(2H/CH2N)、1.542-1.523、1.276(-CH2CH2CH2-)。LCMS(M+1):147.1127。

报道三、

L-赖氨酸的发酵方法包括赖氨酸一级种子培养、赖氨酸二级种子培养和赖氨酸发酵培养三个步骤。每个步骤的具体操作如下：

1、赖氨酸一级种子培养

配制赖氨酸一级种子培养基。本实施例中赖氨酸一级种子培养基包括蔗糖20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸铵9g/L，酵母浸粉5g/L，苏氨酸0.5g/L，蛋氨酸0.5g/L，味精7g/L，丙酮酸钠0.5g/L，醋酸钙1g/L。

将配制好的赖氨酸一级种子培养基，用20％(体积比)氢氧化钾溶液调节pH值为6.0，通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min，开循环水降温至36℃并维持恒定。开搅拌300rpm，按照通风比1：0.4通入无菌空气，调节罐压为0.05Mpa，并用氨水调节pH至6.7并维持恒定，校溶氧100％。

将产赖氨酸大肠杆菌摇瓶种子按赖氨酸一级种子培养基体积的1‰接到赖氨酸一级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧30-50％，培养10h后，每隔2h取样镜检并测总糖，当镜检菌体形态正常且总糖下降至10g/L时停止培养，得到赖氨酸成熟一级种子液。

2、赖氨酸二级种子培养

配制赖氨酸二级种子培养基。本实施例中赖氨酸二级种子培养基包括葡萄糖70g/L，硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸铵10g/L，玉米浆水解液1g/L，毛发水解液1g/L，甜菜糖蜜10ml/L，苏氨酸0.4g/L，蛋氨酸0.4g/L，醋酸钙2g/L。

将配制好的赖氨酸二级种子培养基，用氨水调节其pH值为6.2，通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min，开循环水降温至37℃并维持恒定。开搅拌300rpm，按照通风比1：0.4通入无菌空气，调节罐压为0.05Mpa，用氨水调节pH值为6.6并维持恒定，校溶氧100％。将步骤(1)得到的成熟赖氨酸一级种子液按赖氨酸二级种子培养基体积的2％接到赖氨酸二级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧30-50％，培养10h后，每隔2h取样镜检并测还原糖，当镜检菌体形态正常且还原糖下降至8g/L时停止培养，得到赖氨酸成熟二级种子液。

3、赖氨酸发酵培养

配制赖氨酸发酵培养基。本实施例中赖氨酸发酵培养基包括葡萄糖20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸0.3/L，硫酸铵9g/L，玉米浆水解液0.5g/L，毛发水解液0.5g/L，甜菜糖蜜10ml/L，甜菜碱0.5g/L，醋酸钙1g/L。

将配制好的赖氨酸发酵培养基，用20％氢氧化钾调节其pH指为5.6，通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min，开循环水降温至36℃并维持恒定。开搅拌400rpm，按照通风比1：0.3通入无菌空气，调节罐压为0.07Mpa，用氨水调节pH值为6.7并维持恒定，校溶氧100％。将步骤(2)得到的成熟赖氨酸二级种子液按赖氨酸发酵培养基体积的10％接到赖氨酸发酵培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧25-40％。

培养过程中每2h取样测发酵液的还原糖浓度和氨氮浓度，当发酵液中的还原糖浓度下降至4g/L时，开始流加60％(m/v)葡萄糖溶液并维持发酵液的还原糖浓度为4g/L左右，当发酵液中的氨氮浓度下降至1g/L时，开始流加40％(m/v)硫酸铵溶液并维持发酵液中的氨氮浓度为1g/L左右。

参考文献

[1][中国发明]CN201110456105.4L-赖氨酸的制备方法

[2][中国发明]CN202010925450.7一种游离L-赖氨酸固体的制备方法

[3][中国发明]CN201611239506.3一种L-赖氨酸的发酵方法