人凋亡蛋白酶激活因子1(APAF-1)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人凋亡蛋白酶激活因子1(APAF-1)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）检测样本中人凋亡蛋白酶激活因子1(APAF-1)的含量。

原理：往预先包被人凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人凋亡蛋白酶激活因子1(APAF-1)ELISA试剂盒

操作步骤：

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马神经元超微结构及Apaf-1表达的影响研究

观察黄芪注射液对大鼠脑缺血再灌注海马神经元超微结构及凋亡相关基因Apaf-1表达的影响。

方法:将清洁级健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、黄芪注射液组和黄芪注射液溶剂对照组。采用四血管阻断法建立脑缺血再灌注大鼠模型，除假手术组外其余三组根据再灌注不同时间点再分为0h，0.5h，2h，6h，24h，72h和120h7个亚组，于再灌注相应时间点断头取脑。

电镜下观察大鼠海马CA1区神经元超微结构变化；免疫组织化学法检测大鼠海马CA1区神经元Apaf-1的表达；Western blot法检测大鼠海马组织Apaf-1蛋白的表达；RT-PCR法检测大鼠海马组织Apaf-1mRNA的表达。

结果:透射电镜结果显示：假手术组海马CA1区神经元胞核较大，呈圆形或椭圆形，核膜清晰完整，常染色质呈细颗粒状均匀分布，胞浆内可见丰富的细胞器。

模型2h组海马CA1区神经元核膜凹陷，核染色质密度增高，线粒体轻微肿胀；模型24h组海马CA1区神经元核膜皱缩严重，核仁物质增多、偏移，线粒体结构松散、空泡状，线粒体嵴断裂，粗面内质网脱颗粒；模型72h组海马CA1区神经元核固缩，核染色质呈团块状边集于核膜下，线粒体不同程度脱空。

黄芪注射液2h组海马CA1区神经元核膜较光滑，染色质细小而分散，线粒体无明显肿胀；黄芪注射液24h组海马CAI区神经元核皱缩改善，核膜较光滑，染色质细小而分散，胞质肿胀明显改善；黄芪注射液72h组海马CA1区神经元核固缩不明显，核膜较光滑，染色质细小而分散，胞质肿胀有所改善。

免疫组化、Westernblot和RT-PCR结果显示：除0h和120h外，模型组各个时间点Apaf-1蛋白及mRNA表达均较假手术组增加（P<0.05）；与模型组相比，黄芪注射液组各个时间点Apaf-1蛋白及mRNA表达均显著性减少（P<0.05），而黄芪注射液溶剂对照组各时间点与模型组相比则均无显著性变化（P>0.05）。

参考文献

[1]Up‐regulation of p53 and mitochondrial signaling pathway in apoptosis by a combination of cox‐2 inhibitor,celecoxib and dolastatin 15,a marine mollusk linear peptide in experimental colon carcinogenesis[J].Honit Piplani,Vivek Vaish,Chandan Rana,Sankar N.Sanyal.Mol.Carcinog..2013(11)

[2]Sodium fluoride induces apoptosis in mouse embryonic stem cells through ROS-dependent and caspase-and JNK-mediated pathways[J].Tam Dan Nguyen Ngoc,Young-Ok Son,Shin-Saeng Lim,Xianglin Shi,Jong-Ghee Kim,Jung Sun Heo,Youngji Choe,Young-Mi Jeon,Jeong-Chae Lee.Toxicology and Applied Pharmacology.2012(3)

[3]Apaf-1 deficiency confers resistance to ultraviolet-induced apoptosis in mouse embryonic fibroblasts by disrupting reactive oxygen species amplification production and mitochondrial pathway[J].Rentian Feng,Jie Han,Judith Ziegler,Minying Yang,Vincent Castranova.Free Radical Biology and Medicine.2011(5)

[4]Mimosine-Induced Apoptosis in C6 Glioma Cells Requires the Release of Mitochondria-Derived Reactive Oxygen Species and p38,JNK Activation[J].Shanlou Qiao,Keiko Murakami,Qinghong Zhao,Baoling Wang,Hisao Seo,Hitoshi Yamashita,Xiaotao Li,Takashi Iwamoto,Masatoshi Ichihara,Masataka Yoshino.Neurochemical Research.2012(2)

[5]刘瑞.黄芪注射液对脑缺血再灌注大鼠海马神经元超微结构及Apaf-1表达的影响[D].承德医学院,2013.