大鼠二氨氧化酶(DAO)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠二氨氧化酶(DAO)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠二氨氧化酶（DAO）水平。用纯化的大鼠二氨氧化酶（DAO）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入二氨氧化酶（DAO），再与HRP标记的二氨氧化酶（DAO）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠二氨氧化酶（DAO）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠二氨氧化酶（DAO）浓度。

大鼠二氨氧化酶(DAO)ELISA试剂盒示意图

操作步骤

1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在、第二孔中分别加标准品100μl，然后在、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为600U/L，400U/L，200U/L，100U/L，50U/L）。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于富氢水对大鼠急性胰腺炎时肠黏膜屏障的保护研究

探讨富氢水（Hydrogen water）对胰胆管逆行推注5%牛磺胆酸钠溶液诱导的急性胰腺炎（Acute pancreatitis）SD大鼠模型的肠黏膜屏障功能（intestinal mucosal barrier）的影响,使急性胰腺炎的临床预防、治疗以及预后有一个新的治疗手段。

方法:1.45只雄性SD大鼠采用经典的造模方法即胰胆管逆行推注5%牛磺胆酸钠溶液来对大鼠进行急性胰腺炎的造模。模型制造完成后将大鼠根据统计学中的随机对照的原则随机分为A组（假手术组）、B组（富氢水组）、C组（生理盐水组）。

2.模型建立成功以后分别于12小时、24小时、36小时每组各取5只实验的大鼠行手术开腹,使用采血针通过穿刺门静脉收集大鼠的全血2ml,等待低温离心机完成离心过程以后,然后用吸管吸出其中的上清液,在收取材料完成以后处死相应的实验大鼠。检测实验大鼠的血浆D-乳酸及DAO（二氨氧化酶）含量。

参考文献

[1]Hydrogen inhalation reduced epithelial apoptosis in ventilator-induced lung injury via a mechanism involving nuclear factor-kappa B activation[J].Chien-Sheng Huang,Tomohiro Kawamura,Ximei Peng,Naobumi Tochigi,Norihisa Shigemura,Timothy R.Billiar,Atsunori Nakao,Yoshiya Toyoda.Biochemical and Biophysical Research Communications.2011(2)

[2]Abdominal compartment syndrome:a new indication for operative intervention in severe acute pancreatitis[J].K.Wong,C.F.Summerhays.International Journal of Clinical Practice.2005(12)

[3]Biliary pancreatitis-associated ascitic fluid activates the production of tumor necrosis factor-αin acinar cells[J].Laura Ramudo,Manuel A.Manso,Isabel De Dios.Critical Care Medicine.2005(1)

[4]Meta-analysis of parenteral nutrition versus enterai nutrition in patients with acute pancreatitis[J].Paul E Marik,Gary P Zaloga.BMJ:British Medical Journal.2004(7453)

[5]陈永强.富氢水对大鼠急性胰腺炎时肠黏膜屏障的保护[D].山西医科大学,2015.