鬼臼毒素合成通路的代谢及转录分析

桃儿七（Sinopodophyllum hexandrum (Royle) Ying） 是小檗科桃儿七属多年生草本植物，植株高20-50厘米早在 1992 年桃儿七就被《中国植物红皮书》收录。“桃儿七”属于“太白七药”之一，具有神奇的抗癌作用，其根和根茎中含有大量的具有抗癌活性的木脂素类物质，其中鬼臼毒素 (podophyllotoxin) 抗癌活性最高，是合成GP7，VP216(etoposide) 和 VM 226 (teniposide) 等抗癌药物的起始物。由于根状茎与果实入药，而被任意采挖，天然繁殖能力较弱，随着植被的破坏而导致其生长环境的改变，植株日益稀少，分布区日渐缩减。

目前许多临床药物是通过天然的植物代谢物合成的，但是只有一小部分植物代谢物的合成通路是已知的，这就成为这些天然代谢物的批量化生产的限制条件。鬼臼毒素是一种木酚素，是抗肿瘤药物依托泊苷的前体，本身并没有拓扑异构酶抑制剂功能，但经过一系列化学修饰后形成的依托泊甙具有拓扑异构酶抑制剂活性，能够发挥抗肿瘤作用，合成通路只有部分是已知的，目前只能依靠天然的植物产生的代谢物合成依托泊苷。因此，完整的鬼臼毒素的合成通路将有助于帮助依托泊苷的工厂化生产。

研究材料：物理损伤的离体桃儿七的健壮叶片

技术平台：LC-MS，RNA-seq，转基因

方案设计：

1）利用LC-MS检测方法，检测物理损伤后不同时间的桃儿七种鬼臼毒素的含量，发现叶片受伤后在12，24h后鬼臼毒素含量达到；

2）根据LC-MS检测结果，对桃儿七叶片进行转录组测序，取样时间0，3，9，12h，每个样品三个重复，根据转录组信息及公共数据筛选与鬼臼毒素合成相关的基因；

3）利用转基因的方法，将候选基因转到烟草叶片中，并利用LC-MS方法检测烟草叶片中代谢物含量的变化，找到鬼臼毒素合成通路的调控基因。

研究结果：

在鬼臼毒素的生物合成通路中，前期的基因是已知的。如图1所示，DIR，PLR，SDH，CYP719A23这4个鬼臼毒素合成相关的前期基因是已知的。后期基因及中间代谢物通路不清楚，但是合成通路中的已知亚太因（yatein）和去氧鬼臼毒素（deoxypodophyllotoxin）以及鬼臼毒素是已知的。作者利用公共数据库中的桃儿七鬼臼毒素相关转录组信息进行分析发现，DIR，PLR，SDH，CYP719A23这4个基因都是高表达的。选择公共数据库中与已知基因具有相似表达的候选基因，筛选到4个O-甲基转移酶（OMT1-4）基因，12个细胞色素P450（CYP）基因和2个氧代戊二酸/ Fe（II）-依赖性双加氧酶（2-ODD）基因。

下一步作者利用代谢组及转基因的方法进行基因的验证。用含有罗汉松树脂酚（（-）-matairesinol）培养基培养烟草离体叶片，将上文中预测到的基因分别与CYP719A23转到烟草叶片中。利用LC-MS方法检测转入以上基因1d后叶片，发现只有转入OMT3基因的叶片中pluviatolide被大量消耗，说明OMT3控制合成pluviatolide的下一个产物，经解谱分析，产物为（-）-5’-desmethoxy-yatein。将剩余的候选基因分别与CYP719A23和OMT3转入到含有罗汉松树脂酚（（-）-matairesinol）培养基培养烟草离体叶片，经LC-MS检测并未发现（-）-5’-desmethoxy-yatein的消耗。

作者前期的实验发现，损伤桃儿七叶片后鬼臼毒素的含量急剧升高，利用LC-MS检测发现鬼臼毒素及其前体物质在12,24h含量达到最高。利用RT-PCR验证发现与鬼臼毒素合成相关的前期5个基因表达量在9h达到最高（图2）。

图2 物理损伤后已知鬼臼毒素合成基因RT-PCR结果

根据已知的结果，作者对受伤的桃儿七叶片进行转录组测序，处理时间为受伤后0，3，9，12h，每个处理三个重复，共12个样品。对转录组数据进行分析，根据推测鬼臼毒素合成需要用到的酶有四种，分别为O-甲基转移酶（O-methyltransferase，OMT），细胞色素P450（cytochromes P450，CYP），2-氧化戊二酸/Fe(II)依赖的双加氧酶（2-oxoglutarate/Fe(II)-dependent dioxygenase，2-ODD），以及多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO），通过寻找与这四种酶家族同源的基因找到，336个，对这336个基因进行层次聚类分析得到91个表达模式相同的基因，对91个基因进行表达量分析，找到22个高表达基因，这22个基因中包含有7个具有已知酶功能的基因，其中一个基因为OMT3（图3）。

图3 22个高表达基因的聚类图

标黑的为已知鬼臼毒素合成基因，红色为筛选的7条候选基因

下一步作者的工作是对这6条候选基因进行验证如图4所示。6个候选基因分别与CYP719A23和OMT3转移到用含有(-)-matairesinol培养基培养4d后烟草叶片中去，1d后利用LC-MS方法检测鬼臼毒素合成相关代谢物含量。通过对含有6种候选基因叶片的LC-MS比较分析，发现在含有CYP71CU1基因的Phex524样品中观察到(-)-5’-desmethoxy-yatein（5’去甲氧基亚太因）含量的变化，并通过质谱鉴定发现了一个高含量的物质，为(-)-5’-desmethyl-yatein（5’去甲基亚太因）。为了完成(-)-yatein（合成鬼臼毒素的中间产物）的合成通路，将剩余的5个基因与CYP719A23,OMT3,和CYP71CU1，分别转移到含有(-)-matairesinol培养基培养烟草叶片中去。对这些叶片进行LC-MS分析，结果发现含有OMT1基因的叶片未检测到(-)-5’-desmethoxy-yatein（5’去甲氧基亚太因），但是检测到了(-)-yatein（亚太因）的高表达，说明OMT1基因诱导(-)-5’-desmethyl-yatein（5’去甲基亚太因）产生(-)-yatein(亚太因)。在yatein（亚太因）到deoxy-podophyllotoxin（脱氧鬼臼毒素）的合成路径中，涉及到了芳基四氢萘骨架中的中心六元环闭合和氧化修饰。在上一步的试验中，检测到了含有2-ODD的样品中的(-)-5’-desmethoxy-yatein（5’去甲氧基亚太因）大量消耗，对应产生了5’-desmethoxy-deoxy-podophyllotoxin（5’去甲基脱氧鬼臼毒素）。我们假设反应机制涉及通过羟基化，随后脱水和碳-碳键形成活化7’碳，通过醌甲基化物中间体形成。因此假设2-ODD可以将yatein（亚太因）合成到(-)-deoxy-podophyllotoxin（脱氧鬼臼毒素）。于是作者将2-ODD，CYP719A23，OMT3，CYP71CU1和OMT1一起转移到烟草叶片中，经过LC-MS检测发现叶片中yatein（亚太因）被大量消耗而(-)-deoxy-podophyllotoxin（脱氧鬼臼毒素）含量增加，因此可以确定2-ODD基因可以促进生成(–)-deoxy-podophyllotoxin。为了验证(-)-deoxy-podophyllotoxin（脱氧鬼臼毒素）到podophyllotoxin（鬼臼毒素）生物合成通路，将公共数据库里6个CYP候选基因分别于其他几个已经确定的基因转移到烟草叶片中，经过LC-MS分析发现，6种类型的叶片均未发现podophyllotoxin（鬼臼毒素）合成，但是意外的是作者发现转移CYP71BE54基因的叶片(-)-deoxy-podophyllotoxin（脱氧鬼臼毒素）被大量消耗，而检测到大量的(-)-4’-desmethyl-deoxy-podophyllotoxin（4’去甲基脱氧鬼臼毒素）。在筛选其他的基因是发现CYP82D61能够使得 (-)-4’-desmethyl-deoxy-podophyllotoxin（去甲基脱氧鬼臼毒素）大量消耗，得到(–)-desmethyl-epipodophyllotoxin（去甲基表鬼臼毒素）。虽然没有产生podophyllotoxin（鬼臼毒素）但是产生了podophyllotoxin（鬼臼毒素）的差异构象体（表鬼臼毒素）。而表鬼臼毒素与抗癌药物依托泊甙结构更相近，仅需一步化学修饰就可以合成依托泊甙。

图4 转入相应基因后matairesinol培养基内烟草叶片中鬼臼毒素中间代谢物的含量

为了验证整个结果的准确性，作者将10个基因一起转入到含有（+）-pimoresinol的培养基内培养，并利用LC-MS检测鬼臼毒素合成通路代谢物含量，结果中发现了(–)-4′-desmethylepipodophyllotoxin（4’去甲氧基表鬼臼毒素），而其他对照试验，只转入10个基因，或转入GFP+（+）-pimoresinol的均为检测到(–)-4′-desmethylepipodophyllotoxin（4’去甲氧基表鬼臼毒素）的生成如图5。

图5  B 不同条件处理下的烟草叶片LC-MC提取离子流图（箭头代表(–)-4′-desmethylepipodophyllotoxin糖苷配基）C 不同处理条件下检测到的 (–)-4′-desmethylepipodophyllotoxin含量

最终，作者完成了鬼臼毒素完整的合成通路，并且实现了体外烟草中鬼臼毒素的合成。