人胃成纤维细胞的应用

背景^[1-3]

人胃成纤维细胞来源于手术切除的正常胃组织的成纤维样细胞，贴壁生长，纤维连接蛋白（Fibronectin）或波形蛋白（Vimentin）免疫荧光染色为阳性，不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

胃是人体的消化器官，位于膈下，胃壁由黏膜、黏膜下层、肌层和外膜四层组成，并有神经、血管和淋巴管的分布。其中成纤维细胞主要分布于粘膜层中的固有层、黏膜下层和外膜层。

成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，电镜下，成纤维细胞胞质内可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和高尔基复合体，表明其具有合成和分泌蛋白质的功能。己知成纤维细胞的主要功能之一是合成胶原蛋白及其他细胞外基质，在组织器官纤维化过程中发挥重要作用。

人胃成纤维细胞培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于转化生长因子-β1在人胃粘膜成纤维细胞转化过程中的作用及其在胃癌组织和血清中的表达意义研究

探索培养液中TGF-β1浓度与原代胃粘膜成纤维细胞发生转化之间的关系;研究不同TNM分期的胃癌组织及血清中TGF-β1表达情况及其意义。

方法:（1）原代培养HGMF,流式细胞学方法检测细胞Desmin、Vimentin、TSP-1、FAP-a、Collagen III及Collagen I表达情况。分别调整培养液TGF-β1浓度为5、10、15pg/ml,收集不同代数的细胞进行检测:透射电镜检测细胞超微结构,计数法测定细胞生长曲线,BSA法检测细胞总蛋白含量。

（2）免疫组织化学SP法检测分析40例胃癌石蜡切片组织中TGF-β1的表达;ELISA法检测上述病例患者血清中TGF-β1的表达量。

结果:原代分离的HGMF表达Desmin阴性、Vimentin阳性、TSP-1阴性、FAP-a阴性、Collagen III阳性、Collagen I阳性;B2、B3、C2、C3四组细胞电镜下可见胞浆内线粒体肿胀、增多,有形态学上的改变。第8代细胞比较无明显差异。第12代细胞比较,C2生长速度明显比B2及P2快（P<0.01）,而B2与P2比较两者无显著差异。

第16代细胞比较,C3、B3生长速度明显比及P3快（P<0.01）,而C3与B3比较两者无显著差异。1×106个第12代细胞B2、C2、P2蛋白含量分别为0.3747±0.0308mg/ml、0.5292±0.0407mg/ml和0.3697±0.0476mg/ml（B2与C2比较,P=0.000;B2与P2比较,P=0.833;C2与P2比较,P值=0.000）。1×106个第16代细胞B3、C3、P3蛋白含量分别为0.5323±0.0413mg/ml、0.5415±0.0482mg/ml和0.3704±0.0421mg/ml（B3与P3比较,P=0.000;C3与P3比较,P=0.000;B3与C3比较,P值=0.723）。

参考文献

[1]Serum levels of transforming growth factor betal in patients with breast cancer.Sheen-Chert SM,Chen HS,Sheen CW,etal.Archives of Surgery.2001

[2]TGF-beta receptor-mediated signalling through Smad2,Smad3 and Smad4.Nakao A,Imamura T,Souchelnytskyi S,et al.EMBO Journal.1997

[3]Smad transcription factors.Massague J,Seoane J,Wotton D.Genes and Development.2005

[4]The TGF beta superfamily signaling pathway.WEISS A,ATTISANO L.WIREs Dev Biol.2013

[5]柴华.转化生长因子-β1在人胃粘膜成纤维细胞转化过程中的作用及其在胃癌组织和血清中的表达意义[D].第二军医大学,2017.