普通DNA产物纯化试剂盒的应用

背景^[1-3]

普通DNA产物纯化试剂盒使用独特的离心吸附柱高效、专一地与DNA片段结合，同时限度除去蛋白质、离子及引物小片段等杂质。除了可用于PCR产物回收，对于一些酶反应液回收（酶切、连接、探针标记等）也同样适用。可回收100 bp-20 kb，DNA片段，回收率可高达80%以上（＜100 bp或＞10 kb的DNA片段，回收率为30%-50%）。得到的DNA可直接用于连接、转化、酶切、测序、杂交等分子生物学实验。

产品特点：

速度最快:15 min完成DNA回收，可同时处理多个样品，节省时间。

步骤最少:操作简单，几次离心即可完成。

效率最高:独特的离心柱和精心配制的缓冲液保证每次量回收到

纯度极高的目的DNA。

处理量:每个离心吸附柱每次最多可吸附的DNA量为10μg。

应用^[4][5]

用于基因治疗用质粒DNA生产及产物纯化的研究

研究了含有重组质粒pcDNA3.1-IL-24工程菌的构建、发酵、大规模裂解条件,重组质粒pcDNA3.1-IL-24分离纯化路线以及质量检测体系的建立。

首先将已构建好的重组质粒pcDNA3.1-IL-24转化大肠杆菌E.coli DH5a,构建rh-IL-24工程菌,考察工程菌的传代稳定性后,在BIOFLO 40L发酵罐中,通过补料分批发酵的方式,流加发酵培养液,控制发酵温度在36℃-38℃之间、发酵培养对数生长期溶解氧浓度控制在30%-50%之间,PH保持在7.0左右的发酵参数上罐发酵。16h结束发酵后,收获菌体约为36g湿菌体/L。

离心收集菌体,使用碱裂解法大量制备粗制质粒DNA,先通过盐沉淀法粗纯质粒DNA,然后使用离子交换层析、疏水层析、分子筛层析进一步纯化,最后进行无菌超滤,将质粒DNA浓缩到药用剂量后分装到安瓿里保存。

依照国家食品药品监督局颁布的《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》,建立了相应的检测体系,对质粒DNA产品进行质量鉴定,结果表明,本工艺制备的质粒DNA外观澄清、无杂质；pH值为7.2；质粒DNA浓度为727μg/mL；纯度（OD260/OD280）为1.87；杂质蛋白含量为O.007μg/μg质粒DNA；无RNA和抗生素残留；细菌内毒素小于0.007EU/μg质粒DNA。

检测结果符合药用标准。与传统实验室方法相比,本工艺生产流程避免使用有毒试剂（苯酚、氯仿）和动物源性酶类（RNase A）,确保了产品的安全性的同时,也减少了检测有毒试剂残余量的繁琐步骤；本工艺使用的大都是价格低廉的国产试剂,所用的材料和设备（凝胶、反应器等）可以反复再生使用。

生产周期较短,满足了实际生产需求,具有良好的经济性；此外,本工艺操作简单、易于放大、重复性好,并且建立了相应的质粒DNA质量检测体系,对于药用级质粒DNA大规模制备具有重要的现实意义,也为同类研究的进行奠定了理论基础,为进一步的工业化生产提供了借鉴。

参考文献

[1]Purification of pharmaceutical-grade plasmid DNA by anion-exchange chromatography in an RNase-free process[J].Alex Eon-Duval,Gemma Burke.Journal of Chromatography B.2004(2)

[2]Removal of RNA impurities by tangential flow filtration in an RNase-free plasmid DNA purification process[J].Alex Eon-Duval,Robert H MacDuff,Carol A Fisher,Mark J Harris,Chris Brook.Analytical Biochemistry.2003(1)

[3]Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications[J].Guilherme N.M.Ferreira,Gabriel A.Monteiro,Duarte M.F.Prazeres,Joaquim M.S.Cabral.Trends in Biotechnology.2000(9)

[4]Gene therapy:the first decade[J].Andrew Mountain.Trends in Biotechnology.2000(3)

[5]韩依辰.基因治疗用质粒DNA生产及产物纯化的研究[D].长春工业大学,2010.