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制备d-天门冬氨酸的方法和组合物

发布日期:2020/12/11 16:50:01

背景

本发明阐述一种从消旋的天门冬氨酸中制备D-天门冬氨酸的方法。更具体来说,本发明阐述通过消旋的天门冬氨酸的酶促脱羧作用,制备D-天门冬氨酸和β-丙氨酸的方法。

相关技术描述L-天门冬氨酸-α-脱羧酶催化从L-天门冬氨酸中产生β-丙氨酸。Nakano等表明了来自大肠杆菌B株的粗提取物中有此酶活性。Nakano,Y.等,生物化学杂志;70卷,327-334页(1971)。Williamson等进一步研究了把大肠杆菌中的该酶纯化到表观均一后的酶活性。Williamson,J等,生物化学杂志,254(16)卷,8074-8082页(1979年8月)。这些发明的文献并不说明除了实验的好奇外,能产生任何可实际应用的酶量。正如下面更全面讨论的那样,本发明利用一种组合物,使L-天门冬氨酸-α-脱羧酶的活性为Nakano等和Williamson等文献中发表的该酶活性的100~2000倍。

在给Rozzell的美国专利号5,019,509中公开了产生L-丙氨酸和其衍生物的方法和组合物。然而,Rozzell公开了编码天门冬氨酸-β-脱羧酶的基因以及用于产生L-丙氨酸。在给Houng的美国专利号5,552,317和5,552,318中,公开了用来自小麦胚或解脂假丝酵母(Candida lipolytica)的脂肪酶制备旋光活性氨基酸和其酯类的方法。相比之下,本发明的方法不是如Houng等方法那样的常见转变方法,常见的方法是,氨基酸的转变实际上依靠氨基酸的衍生物进行,因而需要额外的化学步骤。最为常见的方法是,外消旋酯类用酯酶/脂肪酶处理,或N-乙酰氨基酸用酰基酶处理。

已知的其他转变程序是应用酰胺酶,作用于消旋的氨基酸酰胺,其中该酶恰特异地针对一种异构体。见美国专利号4,880,737。然而,本发明提供一种更为简单的方法,因为不用额外的化学修饰以制备底物。

本发明提供容易的途径,从丰富的资源D,L-天门冬氨酸中,产生2种广泛使用的化合物。在药用中,已有大量的文献描述D-天门冬氨酸和其衍生物。这些应用包括,但不局限于抑制精氨酸基琥珀酸合成酶活性和用作免疫抑制剂。抑制精氨酸基琥珀酸合成酶活性,可用于预防或治疗脓毒症或细胞因子诱导的系统性低血压。D-天门冬氨酸的其它应用包括作食物的味觉修饰组合物,和由Pfizer开发的一种新甜味剂,AlitameTM。另外,β-丙氨酸用于泛酸的合成,而泛酸对辅酶A的合成是必需的。也已知β-丙氨酸用作手性合成子合成α-替代的β氨基酸。β-丙氨酸的衍生物已被用作电镀业中的缓冲液。

制备方法

质粒pIF309的制备编码L-天门冬氨酸-1-脱羧酶的panD基因,从大肠杆菌K12染色体中,用下列PCR方法分离

A.染色体DNA制备大肠杆菌W3110菌株从Coli遗传贮存中心(耶鲁大学,Newhaven,CT)获得。菌株按照提供者的指示复苏,在500ml培养瓶中37℃下,50ml体积的Luria肉汤中摇动培养过夜。10ml等份培养物10,000×g离心4分钟。弃去上清液,沉淀重新悬浮在1ml的含50mM Tris/HCl pH8.0,10mM EDTA和100μg/ml RNaseA(Sigma)的溶液中。溶液在室温下温育10分钟。加入2ml的含0.4%(w/v)十二烷基硫酸钠(“SDS”)和100μg/ml蛋白酶K(Sigma)的溶液。37℃下温育溶液20分钟。加入pH5.2的乙酸钠至终浓度为300mM。然后,该溶液用37℃的等体积的苯酚抽提3次,用2.5倍体积的乙醇沉淀。然后用无菌环移取DNA,DNA重新溶解在400μl pH5.2的300mM乙酸钠中。然后,DNA用2.5倍体积的乙醇重新沉淀,按前述的方法移取,干燥,溶在500μl的10mM Tris pH8.0和1mM EDTA中。终浓度大约为200μg/ml。

B.通过PCR扩增panD通过PCR扩增大肠杆菌panD基因,用0.2ml MicroAmpTM反应管(Perkin Elmer,Norwalk,CT)完成,在反应管中加入100ng如上述制备的大肠杆菌染色体DNA,dATP、dGTP、dCTP和dTTP(每种10mM)各2μl,10μl含有15mM MgCl、500mM KCl、100mM TrispH8.3的缓冲液和0.01%(w/v)明胶,5U Taq DNA聚合酶(AmpliTaqTM)和5μl 10nmol/ml的下列每种寡核苷酸引物溶液,寡核苷酸引物根据已知的方法,用应用生物系统380B DNA合成仪合成。(MB1682)5′CGC GGA TCC ACT ATG ATT CGC ACG ATG CTG CAG GGC 3′(MG1683)5′CAG CGT GCA TGC TCA AGC AAC CTG TAC CGG AAT CGC 3′反应在Perkin Elmer 9600TMPCR热循环仪(Perkin Elmer)中进行。扩增反应按下列方法进行,94℃预热3分钟,接着94℃变性30秒,50℃退火30秒,72℃延伸2分钟,共30个循环。然后反应混合液贮存在4℃。

C.panD的克隆扩增的panD基因克隆到来源于质粒pBR322的质粒载体上。该质粒命名为pIF309。含有panD基因的片段用限制性酶BamHI和SphI完全消化,连接到相似方式切割的载体单独BamHI和SphI位点之间。在HindIII和BamHI之间插入合成的DNA片段,该DNA片段带有大肠杆菌K12 pheA启动子区的修饰变体。该片段完全在应用生物系统380BDNA合成仪上合成,资料来源于与Fotheringham等共有的美国专利5,120,837。上述序列见如下:HindIIIAAGCTTTTTTGTTGACAGCGTGAAAACAGTACGGGTATAATACTAAAGTCACAAGGAGGATCCBamHI质粒pIF309在图1中显示。限制性消化用由新英格兰生物实验室公司提供的酶进行,根据制造商的具体说明(NEB,Beverly,MA)使用。使用由Takara生物化学公司(Panvera Corp.,Madison WI)提供的连接反应试剂盒,根据制造商的具体说明进行DNA片段连接。

通过从按如下描述生长的NS3291菌株培养物制备的提取液中,生物学测定L-天门冬氨酸-1-脱羧酶活性确定panD的表达。