基因敲除详解

基因敲除

基因敲除（knockout）是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。

指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。基因嵌入又称基因置换，它是利用内源基因序列两侧或外面的断裂点，用同源序列的目的基因整个置换内源基因。用于基因敲除和基因嵌入的技术有Cre/Lox P系统、FLPI系统等。

步骤：

获得干细胞

基因敲除一般应用于鼠，而最常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用，最来自于C57BL/6×CBN/JNCrjF1小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。由于这些远交系遗传背景复杂，所得到的模式小鼠往往不能得到重复性好的实验结果，所以也需要在C57BL/6等近交系小鼠上做回交。另一方面，因为回交次数不一样，也会造成实验结果重复性差。这对生物科研，尤其是医药企业，安评中心，药检部门等，是一个很大的缺点。这对开发制作标准模式动物也是一个很大的缺陷。所以，如果能够直接用C57BL/6 ES细胞进行基因打靶，就将直接获得C57BL/6品系的模式小鼠。c57BL/6小鼠种系等已经广泛的应用于免疫学，神经学，癌症，等几乎所有研究领域。已经有一些公司或科研机构已经开始用C57BL/6遗传背景的胚胎干细胞进行基因打靶。

载体构建

把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，此重组载体即为打靶载体。因基因打靶的目的不同，此载体有不同的设计方法，可分为替换性载体和插入型载体。如为了把某一外源基因引入染色体DNA的某一位点上，这种情况下应设计的插入型载体要包括外源基因(即目的基因)、同源基因片段及标记基因等部分。如为了使某一基因失去其生理功能，这时所要设计的替换型打靶载体，应包括含有此靶基因的启动子及外显子的DNA片段及标记基因等诸成分。根据实验目的不同，打靶载体分为全基因敲除，条件性基因敲除，基因敲进，诱导性基因敲除等打靶载体。

导入基因

将基因打靶载体通过一定的方式(常用电穿孔法)导入同源的胚胎干细胞(EScell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达。一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。

用选择性培养基筛选已击中的细胞

一般地，筛选使用正、负选择法，比如用G418筛选所有能表达neo基因的细胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表达的细胞，剩下的细胞为命中的细胞。由于用于TK筛选的Gancyclovir对小鼠的种系传递有影响，一般采用DTA(白喉毒素A亚基）进行阴性筛选。将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚中，再将此囊胚植人假孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠。

性状改变

通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学性状的改变，达到研究目的基因的目的。

条件性基因敲除法 

条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。

条件性敲除的原理: 

利用Cre/LoxP 和来自酵母的FLP—frt 系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型。通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将“loxP floxed”小鼠与Cre 转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。在“loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。但当它与Cre 转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。Cre 基因表达产生的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发生切除反应，结果将一个loxP 和靶基因切除。这样，靶基因的修饰(切除)是以Cre 的表达为前提的。Cre 的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。所以只要控制Cre 的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。

诱导性基因敲除法 

诱导性基因敲除也是以Cre/loxp 系统为基础，但却是利用控制Cre 表达的启动子的活性或所表达的Cre 酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre 基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP 动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型(图4)；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。

诱导性基因敲除优点：

① 诱导基因突变的时间可人为控制； ② 可避免因基因突变而致死胎的问题 ③ 在2 个loxP 位点之间的重组率较高；  ④如用病毒或配体/DNA 复合物等基因转移系统来介导Cre 的表达，则可省去建立携带Cre 的转基因动物的过程。