基因敲除的策略与应用

背景及概述^[1-2]

基因敲除亦称基因剔除。依据DNA同源重组原理建立，用以推测基因功能的技术。该技术对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，应用基因打靶方法，将该基因完全去除、修饰或用其他序列相似基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应的基因功能。基因敲除动物模型被广泛地应用于研究与营养素代谢、生物转化和生物学功能相关的基因及其功能，以及营养失调相关疾病的发病机制等。

步骤^[3]

基因敲除的一般流程见图

基本程序是：用PCR技术扩增目的基因序列，在体外插入卡拉霉素、四环素等受体菌原先不具有的抗性标记，使目的基因失活，再将失活的目的基因构建至一环状载体上，用电转化、显微注射等方法将构建好的载体转化入受体细胞内，以抗性标记初步筛选阳性菌或进行目的基因功能的失活检测，再以PCR，southern杂交等做进一步验证。

现在，为了更好地区别单交换与双交换造成的重组，通常使用两个抗性标记，在发生单交换时，阴性和阳性抗性标记都会整合至基因组，而发生双交换时，第二次同源重组会导致基因回复至野生型或敲除目的基因，在前一种情况下，两种标记都不存在；在后一种情况下，基因组上只有阳性标记，因此这样的敲除子可以通过正负筛选鉴别出。但如果载体构建时在同源序列内部引入一些突变，就不会回复至野生型，这样，既能实现基因的失活，基因组上又不会带有抗性标记，这对构建“食品级”的安全菌株是有益的。在了解微生物代谢途径相关基因的基础上，通过构建合适的敲除载体，利用微生物原有原因与构建的同源重组系统发生交换，进行代谢旁路的阻断，防止副产物或有毒产物的形成，促进目的产物积累，从而达到调节代谢流，优化代谢途径的目的。基因敲除技术既对敲除载体的要求不高可用于原核细胞，也可用于真核细胞，用途广泛。

策略选择^[3]

基因敲除过程中，敲除载体的设计及构建是非常重要的。同时，在载体构建的过程中要考虑建立合理、可靠的筛选方法。同源重组的效率较低，故对重组子的筛选和检测是基因敲除的关键步骤。目前根据不同的目的和要求，因敲除的策略主要有以下几种。

1. 非复制型质粒载体敲除法

对野生菌做基因敲除，可以先考虑用非复制型载体。由于构建好的敲除载体在受体菌中是不复制的，因此转化之后，在选择压力下，未发生重组的转化子由于敲除载体不能复制随着菌体生长而被稀释。利用在地中海拟无枝菌酸菌中不复制的敲除质粒PDK110，成功地用α-淀粉酶基因取代了地中海拟无枝菌酸菌U32染色体上的3-氨基-5-羟基苯甲酸合成酶基因。此法的主要缺点是整合几率低，需要数千碱基的同源序列，且对受体菌的感受态效率要求较高。

2. 不稳定型质粒载体敲除法

若受体菌感受态较难制备，可考虑采用不稳定型敲除载体。例如：2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)是维生素C合成的重要前体，但发现存在高水平的2-酮基醛糖还原酶(2-KR)活力。由于2-KR能够利用NADPH或NADH辅酶将Vc生产菌代谢中重要的中间产物2，5-二酮基-D-葡萄糖酸(2，5-DKG)及2-KLG转化为其他副产物，将失活的2-KR基因构建到pBR322衍生质粒上，这种质粒在受体菌中分配不稳定，在无压力选择或低磷条件下培养5～10代会出现很多质粒丢失的细胞。因此转化后可先控制培养条件使敲除载体随细胞复制以增加转化子的数目，然后再在无压力选择或低磷条件下让质粒丢失，最后在选择压力下筛选敲除子。目前已成功敲除2-KR基因。

3.温度敏感型(Ts型)质粒载体敲除法

1993年利用Ts型质粒建立了革兰氏阳性菌高效的基因敲除系统。Biswas所用质粒pG+host5在37℃时不复制，而28℃时以滚环模式进行复制。因此转化后在选择压力下37℃培养会导致次同源重组sco(single-crossover)，之后将温度降至28℃，会促使质粒发生滚环复制，这种复制机制会导致发生第二次重组dco(double-crossover)。重组后，目的基因或是被敲除，或是回复成野生型。由于使用了Ts型质粒，因此转化后可先在复制温度下培养促进转化子的生长及繁殖。即使外界无抗性选择压力重组机率也会增加。该技术可避免使用抗生素抗性标记，可用于构建“食品安全级”的菌株。由于质粒是以滚环机制复制，重组效率高。Biswas的研究表明在有抗性选择压力时，50%以上的菌发生了替换重组；无抗性选择压力时，替换重组的效率为1%～40%。此外，Ts型质粒宿主谱广，可在很多革兰氏阳性菌中使用。

4.线形转化敲除法

1998年报道了利用λ噬菌体的线性Red同源重组系统获得高重组率。Red系统主要包含3种蛋白质分子，分别称为Exo、Beta和Gam。Exo蛋白具有DNA外切核酸酶活性，从双链DNA末端按5'※3'的方向消化单链DNA。Beta蛋白可结合在由Exo消化产生的3'单链DNA末端，促进该单链DNA末端与互补链退火和体内重组。

Gam抑制宿主菌的重组蛋白RecBCD的线性双链DNA外切酶活性，协助Exo和Beta完成同源重组。Red系统相对于宿主菌来说是一个外来的功能单位，因此必须对其表达进行调控。将部分λ噬菌体的基因整合至E.coli染色体上，exo，beta和gam3个基因受C2857阻遏蛋白的调控表达；将Red系统构建在一个以arac-ParaB为启动子的Ts型质粒上，在阿拉伯糖的诱导下可进行有效表达，而在温度控制下可快速去除此质粒。利用此类质粒快速敲除了痢疾杆菌中的asd基因，之后又利用编码FLP重组酶的Ts型辅助质粒去除了抗性基因，为Red系统在E.coli以外的微生物中的应用进行了尝试。

应用^[2]

基因敲除作为近几十年新兴的一种重要的重组DNA技术，在微生物代谢工程研究中，利用λ噬菌体的Red系统在细菌中进行的基因敲除技术和PCR介导的酵母基因中断技术，广泛应用于构建具有特定突变的工程菌，改变生物代谢途径，阻断副反应的进行，防止副产物或有毒产物形成，促进目的产物积累等方面；在生物医学研究中，RNAi现象广泛存在于真核生物体内，操纵着许多细胞功能，如参与了细胞正常的生长、发育调控，稳定转座子，同时调控机体抵御外病毒的入侵。

主要参考资料

[1] 营养科学词典

[2] 基因敲除技术研究进展

[3] 基因敲除技术及其在微生物代谢工程方面的应用