免疫细胞无血清培养基的应用

背景^[1-3]

免疫细胞无血清培养基是无血清、不含异源动物成分（Xeno-free）的人免疫细胞培养基，可用于人淋巴细胞、CIK、DC、NK等各类免疫细胞的培养，具有很高的成活率、杀伤活性和扩增倍数。

无血清培养基，顾名思义，就是在细胞培养中不需要添加血清，但是在某些应用中可能要添加生长因子或细胞因子。无血清培养基中添加了血清的主要成分：粘附因子、生长因子、必需的营养物质和激素等，能减少血清带来的不利因素，使细胞培养的条件更稳定。经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可简化纯化和鉴定各种细胞产物的程序，避免病毒污染造成的危害。

无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。传统细胞培养基含有异源血清成分，如牛血清，细胞培养中使用牛血清存在污染外源病毒和致病因子的风险：由于不同批次牛血清间的生物活性和因子的不一致，导致产品和实验结果的重现性差。

制品中残留的牛血清易引起接种者对血清的过敏反应。因此，采用牛血清替代物作为添加剂的无血清培养基，添加了粘附因子、生长因子、必需的营养物质和激素等，能减少血清带来的不利因素，使细胞培养的条件更稳定。

应用^[4][5]

用于人类外周血免疫细胞体外培养标准操作规程的建立和个体化差异研究

为确保免疫细胞(DC和CIK)体外采集、分离、培养、冻存等操作规范化和标准化,得到符合临床应用级别的细胞,确保细胞免疫治疗疾病以安全、有效的方式进行,本室遵循国内外相关法规,以及欧盟和中国良好生产规范(Good Manufacturing Practice,GMP)的要求,以期建立DC和CIK体外操作的一系列标准操作规程(Standard Operating Procedure,SOP),并初步制定DC和CIK质量标准。

分别对1例早期乳腺癌、1例晚期卵巢癌和5例健康成年人的免疫细胞,在培养前、后的细胞数量、细胞表型和功能进行比较,初步探讨不同个体间(健康人或肿瘤患者)的免疫细胞表型和功能的差异,为个体化的细胞免疫治疗肿瘤提供初步的实验依据。

方法：以《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》、《白体免疫细胞治疗技术管理规范》、《中国药典》、欧盟GMP、《中国GMP实施指南》等为指导,针对前体细胞-外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)的采集、分离、冻存,DC.CIK培养和扩增、表型鉴定和功能检测等过程,制定SOP；遵循已制定的SOP,对DC和CIK体外培养和检测等过程进行质量控制；对1例早期乳腺癌、1例晚期卵巢癌和5例健康人分离得到PBMC.培养扩增得到的DC和CIK进行免疫相关参数的比较。

结果：1、通过研究,已初步建立一系列DC、CIK体外操作相关的SOP；遵循这些SOP,对免疫细胞体外操作过程进行了质量控制,并初步获得了DC和CIK细胞质量标准。

2、发现在自体血浆培养条件下与在胎牛血清和人AB血清条件下培养得到的DC表型和功能相比,并无显著性差别。

3、呈粘附生长状态的DC与传统的非粘附生长的DC相比,其表型和功能也无显著差别,是质量合格的DC,在收获DC时无需丢弃。

4、免疫细胞个体化差异的初步研究表明：在不同个体间,免疫细胞在培养前后,其细胞数量、表型和功能等方面都存在差异,为个体化的细胞免疫治疗提供了初步的实验依据。

参考文献

[1]Cytokine-induced killer(CIK)cells as feasible and effective adoptive immunotherapy for the treatment of solid tumors[J].Giulia Mesiano,Maja Todorovic,Loretta Gammaitoni,Valeria Leuci,Lidia Giraudo Diego,Fabrizio Carnevale-Schianca,Franca Fagioli,Wanda Piacibello,Massimo Aglietta,Dario Sangiolo.Expert Opinion on Biological Therapy.2012(6)

[2]New adoptive immunotherapy strategies for solid tumours with CIK cells[J].Sharmilan Thanendrarajan,Young Kim,Ingo Schmidt-Wolf.Expert Opinion on Biological Therapy.2012(5)

[3]Clinical Study of Autologous Cytokine-Induced Killer Cells for the Treatment of Elderly Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma[J].Xue-chun Lu,Bo Yang,Rui-li Yu,Xiao-hua Chi,Shuai Tuo,Chao-wei Tuo,Hong-li Zhu,Yao Wang,Chao-guang Jiang,Xiao-bing Fu,Yang Yang,Yang Liu,Shan-qian Yao,Han-ren Dai,Li-li Cai,Bing-jun Li,Wei-dong Han.Cell Biochemistry and Biophysics.2012(1)

[4]The Therapeutic Effect of Cytokine-Induced Killer Cells on Pancreatic Cancer Enhanced by Dendritic Cells Pulsed with K-Ras Mutant Peptide[J].Guang Tan,Xin Zhang,Hongbo Feng,Haifeng Luo,Zhongyu Wang,Charles R.Rinaldo.Clinical and Developmental Immunology.2011

[5]易辉君.人类外周血免疫细胞体外培养标准操作规程的建立和个体化差异研究[D].中南大学,2013.