免疫细胞无血清培养基的应用

背景^[1-3]

免疫细胞无血清培养基是无血清、不含异源动物成分（Xeno-free）的人免疫细胞培养基，可用于人淋巴细胞、CIK、DC、NK等各类免疫细胞的培养，具有很高的成活率、杀伤活性和扩增倍数。

无血清培养基，顾名思义，就是在细胞培养中不需要添加血清，但是在某些应用中可能要添加生长因子或细胞因子。无血清培养基中添加了血清的主要成分：粘附因子、生长因子、必需的营养物质和激素等，能减少血清带来的不利因素，使细胞培养的条件更稳定。经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可简化纯化和鉴定各种细胞产物的程序，避免病毒污染造成的危害。无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。

应用^[4][5]

用于人表皮干细胞的分离和培养的研究

研究表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定方法,观察表皮干细胞在有血清和无血清培养基中的生长特性,并对其在体外的培养条件进行探索,以期在体外获得人表皮干细胞的良好增殖。

方法①采用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法分离出角朊细胞和成纤维细胞,并以人成纤维细胞条件培养基为基础制备表皮干细胞培养基,用以人表皮干细胞（Ⅳ型胶原快速粘附法富集分离）的体外培养,以角朊细胞培养为对照组。观察人表皮干细胞的细胞形态和一般生长状态,比较人表皮干细胞和角朊细胞的克隆形成率和克隆维持时间,同时采用免疫细胞化学法检测β1整合素和K19的表达,鉴定表皮干细胞。②将富集分离出的人表皮干细胞分两组培养,分别加入同源成纤维细胞条件培养基配制的人表皮干细胞有血清培养基和无血清培养基,观察和比较在这两种培养基中的细胞形态、克隆形成率、生长曲线、β1整合素和K19的强阳性表达率。

结果①在Ⅳ型胶原快速包被的培养皿中快速贴壁细胞经继续培养,可见细胞克隆数增多,两周后可见大克隆形成。与角朊细胞相比,表皮干细胞有更强的克隆形成能力并可形成较大克隆,两者的形成率分别为17.04±1.01%和8.72±0.73%,两者比较有显著性差异（P<0.01）;人表皮干细胞β1整合素和K19免疫细胞化学染色呈强阳性。②细胞形态学分析和生长曲线均表明,培养5天前,无血清培养的人表皮干细胞增殖细胞数较有血清培养的多,第9天达到细胞基本融合状态并出现接触抑制;而在有血清培养基中,人表皮干细胞则继续增殖,第11天时达到生长峰值,随后进入平台期。克隆性分析表明,两种培养基培养的表皮干细胞均呈克隆性生长,但比较克隆数目和大小、克隆形成率和克隆持续时间,有血清组明显优于无血清组（P<0.01）。细胞周期分析显示,人表皮干细胞在有血清培养基中G0～G1期细胞比例明显.

参考文献

[1]Isolation of human epidermal stem cells by adherence and the reconstruction of skin equivalents[J].D.-S.Kim,H.-J.Cho,H.-R.Choi,S.-B.Kwon,K.-C.Park.Cellular and Molecular Life Sciences.2004(21)

[2]Epidermal Stem Cells[J].V.V.Terskikh,A.V.Vasil’ev.Biology Bulletin of the Russian Academy of Sciences.2001(6)

[3]An improved method for culture of epidermal keratinocytes from newborn mouse skin[J].Lari H?kkinen,Leeni Koivisto,Hannu Larjava.Methods in Cell Science.2001(4)

[4]Cultivation of human keratinocyte stem cells:current and future clinical applications[J].G.Pellegrini,S.Bondanza,L.Guerra,M.Luca.Medical&Biological Engineering&Computing.1998(6)

[5]邱泽亮.人表皮干细胞的分离和培养的研究[D].江西医学院,2005.