基因表达水平检测服务的操作步骤

概述^[1][2]

基因表达水平检测服务的最终技术目标是能确定所关注的任何组织、百度细胞的RNA的绝对表达量，可以先从样本中抽提RNA，再标记RNA，然后将这些标记物作探针与芯片杂交，就可得出原始样本中不同RNA的量。某基因在生物体内是否表达，往往可以通过 RT-PCR 的方法进行定性检测。并以 b -Actin 或 GAPDH 等看家基因作内参照，对其表达量进行半定量分析或者实时荧光 PCR 全定量分析。

原理^[1][2]

荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 荧光定量PCR技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时反应过程。随着PCR反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，结合相应的软件对产物进行分析，可以得到荧光扩增曲线，计算待测样品初始模版的量。实时荧光定量PCR技术是一次由定性技术向定量技术的飞跃，运用该项技术，可以对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析。

操作步骤^[1][2]

1. 根据基因序列设计扩增目的基因以及看家基因的引物。

2. 提取 RNA ，通过 OD 值测定对 RNA 样品进行定量。

3. RT-PCR 扩增目的基因及看家基因。

4. 产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析结果。

5. 实验完成后，提供完整的实验操作规程、实验报告（含软件分析结果）及引物等实验材料。

主要参考文献

[1] 高雅楠，尹 杰 ，王 月 ，王 然 ，马春晖，李鼎立。梨砧木主要病毒RT—PCR检测。

[2] 温海京，贾超伟，刘芊麟，张喜喜，刘鑫宇，周双海。2种猪冠状病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用。北京农学院学报2019, 34 (1): 51-55