烯醇化酶的应用前景

背景及概述^[1]

烯醇化酶（enolase，酶分类编号：EC4.2.1.11）是糖酵解过程中的一个关键酶，广泛存在于各种生物物种细胞内。由于在进化中的保守性较高，烯醇化酶在很长时间里一直被认为是功能单一的酶类，其结构和催化过程也研究得比较透彻。然而，随着近年来对多种生理学和病理学过程的深入研究，有越来越多的证据表明烯醇化酶参与了这些过程，并在其中扮演了重要的角色。经过多年研究，已对烯醇化酶的功能多样性有一定了解，如其具有晶状体蛋白、热激蛋白和原癌基因调控蛋白等多重功能，而最引人关注的则是其在病原生物侵染寄主过程中所发挥的作用。烯醇化酶参与了多种病原生物对寄主的组织入侵和转移过程，为相关疾病的预防和治疗提供了新思路。近期研究表明，在寄生蜂等昆虫病原生物侵染寄主过程中也发现了烯醇化酶的参与，预示了其在生物防治领域的应用前景。

理化性质^[2]

烯醇化酶由Lohman和Mayerhof发现于1934年，能催化2-磷酸甘油酸（2-PGE）与磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的相互转化。

烯醇化酶是一种金属结合酶，其催化能力的实现需要二价金属离子的存在，天然状况下通常是镁离子与之结合。因为烯醇化酶参与的糖酵解过程在代谢中具有关键性的作用，所以自然界体内各种生物中都存在烯醇化酶。多数生物的烯醇化酶只有1种，但脊椎动物体内一般有3种异构体：α型在多数组织中都有分布，β型仅存在于肌肉组织中，γ型则为神经组织所特有。天然状态下烯醇化酶在脊椎动物中通常以二聚体形式存在，常见组合形式有αα、ββ、γγ、αβ和αγ等5种；而原核生物中则多以八聚体形式存在，如肺炎链球菌Streptococcuspneumoniae和枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis的烯醇化酶均为由4个二聚体形成的八聚体。

分布特征^[2]

烯醇化酶的基本功能是参与糖酵解反应，故其一般大量表达于细胞质中，而近年来研究发现它也能定位在细胞核和细胞表面上，甚至分泌到胞外。如在肾上腺皮质束状带细胞中发现烯醇化酶定位于细胞核内，与II型β-羟基类固醇脱氢酶基因相结合，并调节该基因的表达。然而烯醇化酶的核定位报道并不多，相对而言烯醇化酶在细胞膜表面的定位则更为普遍，A型链球菌groupAstreptococci、牛吸血虫Schistosomabovis、酿酒酵母Saccharomycescerevisiae人造血细胞等很多细胞表面均发现了烯醇化酶的存在。远缘链球菌Streptococcussobrinu和卡氏棘口吸虫Echinostomacaproni的分泌物中也都检测到了烯醇化酶。对烯醇化酶表面定位或分泌的机理的研究很少，蛋白质合成后定位到细胞表面或分泌一般是借助信号肽的帮助，而目前已知的烯醇化酶氨基酸序列中并未发现典型的信号肽，仅发现酿酒酵母的烯醇化酶依赖其N端的169个氨基酸定位到细胞表面，至于其他烯醇化酶是否也以类似的方式定位则仍需进一步研究确定。

病原生物侵染寄主过程中烯醇化酶的作用^[2]

在很多种病原生物表面或分泌物中都有烯醇化酶，这样的定位特征使该蛋白能够与外界环境相互作用。现在有越来越多的证据表明这类在细胞表面或分泌的烯醇化酶参与了病原生物与寄主的互作，在病原生物侵染寄主的过程中起到了重要的作用。

1)人类病原生物

烯醇化酶在人类病原体中研究最多，其最重要的功能就是协助病原生物侵染人类身体组织。以肺炎链球菌为例，该菌是一种重要的人类病原生物，属于革兰氏阳性细菌，能够引发菌血病和脑膜炎等高发病率和高死亡率的严重疾病。肺炎链球菌进入人体后会结合在呼吸道粘膜上，之后继续侵染上皮细胞，在人体组织内扩散，在这一过程中突破组织屏障是必要的过程。肺炎链球菌表面存在烯醇化酶，并且该蛋白能够激活寄主纤溶系统，表现出与组织侵染相关的特性。将肺炎链球菌的烯醇化酶基因突变，再用突变的菌株侵染小鼠，研究者发现突变后的菌株侵染力急剧下降，毒力丧失，充分说明了烯醇化酶在肺炎链球菌侵染过程中的重要作用其他不同种类的人类病原体，如引起中毒性休克综合征的A型链球菌、引起肠胃炎（gastroenteritis）和败血病（septicemia）的嗜水气单胞菌Aeromonashydrophila，引起全身性真菌感染(systemicfungalinfections)的白色念珠菌Candidaalbicans，引起盘尾丝虫病（onchocerciasis）的旋盘尾丝虫Onchocercavolvulus和引起华支睾吸虫病（clonorchiasis）的华支睾吸虫Clonorchissinensis等，其表面都有烯醇化酶的存在，这些烯醇化酶也都能与人的纤溶系统相作用，从而参与侵染人体的过程。除了影响人的纤溶系统外，也有细菌来源的烯醇化酶利用免疫抑制的方式来促进侵染。龋齿链球是一种主要的龋齿病原生物，其感染的群体分布广泛，并且缺乏有效的防治手段。龋齿链球菌能够分泌烯醇化酶，该蛋白可抑制针对T细胞依赖性抗原（T-celldependentantigens）的免疫反应，并且诱导寄主产生白介素10（interleukin-10）以协助其侵染。

2)其他脊椎动物病原生物

在畜牧业中，一些常见的病原生物对寄主的侵染也有烯醇化酶的参与。牛血吸虫病是一种牛、羊等反刍类动物的严重疾病，其病原体为牛血吸虫。牛血吸虫进入寄主体内后会停留并存活在血管中长达数年，而不受寄主的免疫和凝血系统（hemostaticsystems）的影响，其表膜上的烯醇化酶发挥了重要作用。牛血吸虫表膜上的烯醇化酶能激活纤溶系统，从而避免在自身周围形成凝血块，保持在牛血管中的自由状态。猪链球菌Streptococcussuis是重要的猪病原体，能引发败血症等严重疾病，对生猪生产影响较大。猪链球菌表面也存在烯醇化酶，该蛋白能结合并激活寄主纤溶系统成分，加速侵染。当猪链球菌表面烯醇化酶被抗体封闭时，猪链球菌对猪脑毛细血管内皮细胞的结合率和侵染率均大幅下降，证实了烯醇化酶在猪链球菌侵染中的重要作用。

3)昆虫病原生物

随着对昆虫病原生物致病机理的深入研究，最近已有关于烯醇化酶参与病原生物侵染昆虫过程的报道。侵染意大利蜜蜂Apismellifera幼虫的幼虫芽孢杆菌Paenibacilluslarvae会分泌烯醇化酶到幼虫体内，且其芽孢表面也有烯醇化酶的存在。这种烯醇化酶在幼虫芽孢杆菌侵染时表达量会上升，且对蜜蜂幼虫有较高的毒性，已经证实为侵染过程中的毒力因子。无网长管蚜茧蜂Aphidiuservi的畸形细胞表面有烯醇化酶，在豌豆蚜虫Acyrthosiphonpisum体内时会释放该蛋白到蚜虫血腔中，并且富集在蚜虫胚胎表面，推测该蛋白也有促进侵染的功能。此外，金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae的孢子在侵入蝗虫血腔后，其烯醇化酶的表达量也会显著提高，与侵染过程显著相关。后两种烯醇化酶虽还没有直接的证据表明其促进了侵染，但可以推测这两种蛋白应该具有与其他病原生物烯醇化酶类似的功能。

烯醇化酶参与侵染的作用机理^[2]

在脊椎动物体内，烯醇化酶之所以能参与到各种侵染过程中，主要是因为其具有与血纤维溶酶原（plasminogen）结合的特性。血纤维溶酶原是血纤维溶解酶的前体，存在于多数脊椎动物体内，是纤溶系统的关键成分。血纤维溶酶原在血纤维溶酶原激活蛋白（plasminogenactivator）的作用下会切去N端部分序列，转化为具有丝氨酸蛋白酶活性的血纤维溶酶（plasmin），它能转化胶原酶原为胶原酶，然后与之一起降解纤维蛋白和其他细胞外基质如层粘连蛋白和纤连蛋白，形成脊椎动物的纤溶系统。纤溶系统通常参与到伤口愈合、组织重塑、胚胎发育和体内细胞迁移等过程。病原生物表面的烯醇化酶结合血纤维溶酶原后，会加速其活化为血纤维溶酶并引发一系列下游反应，这样病原生物便可以利用寄主纤溶系统降解其组织屏障，以进行组织侵染或迁移扩散。例如，墨西哥利什曼原虫Leishmaniamexicana主要依靠体表的烯醇化酶结合血纤维溶酶原，再通过激活寄主溶纤系统来侵染小鼠组织，当小鼠缺失血纤维溶酶原时，墨西哥利什曼原虫就无法从小鼠皮肤上的病灶扩散到身体其他部位。脊椎动物的病原生物主要利用寄主自身的纤溶系统来突破组织屏障、加速侵染，昆虫中虽然还没有发现血纤维溶酶原系统，但是研究者推测昆虫病原生物很可能利用昆虫体内类似血纤维溶酶原的蛋白来促进侵染。

烯醇化酶在生物防治上的应用前景^[2]

生防因子，如绿僵菌、白僵菌和昆虫病原线虫等，在侵染昆虫寄主过程中都要突破寄主身体组织进入寄主血腔摄取营养以进行大量繁殖，最终杀死寄主。但由于昆虫机体组织形成的物理屏障和免疫系统的存在，病原生物侵染过程较慢，影响其杀虫效果，使实际使用这些生防因子时所需剂量大、成本高，制约了其应用。现已有大量证据表明很多不同种类病原生物的烯醇化酶都能促进对寄主的侵染，并且逐渐发现在病原生物侵染昆虫的过程中烯醇化酶也具有重要作用，说明利用表面或分泌的烯醇化酶来促进侵染过程是很多病原生物所采用的一种通用策略，是不同病原生物应对相似寄主环境产生趋同进化的结果。虽然对于人类和其他脊椎动物来说，病原生物烯醇化酶促进侵染是有害的，但在有害生物防治中，却可考虑利用烯醇化酶这一特性来帮助昆虫病原生物突破寄主组织屏障，快速扩散到寄主体内，以加速其致病过程，最终提高杀虫毒力。由于烯醇化酶主要在寄主身体组织内部起作用，要利用其增强昆虫病原生物的毒力，就必须使昆虫病原生物进入寄主体内后能够表达烯醇化酶，这就需要借助基因工程手段的帮助。近年来随着基因工程技术的飞速发展，对生防因子的遗传改良已有很多尝试，基因工程成为克服生防因子自身局限和提高杀虫毒力的最有效途径。

如将几丁质酶基因转入球孢白僵菌Beauveriabassiana中使之超表达，重组菌株对桃蚜Myzuspersicae的致死中浓度降低81%以上，致死中时间也降低14%以上，杀虫活性显著提高。因此，采用转基因技术将烯醇化酶转入昆虫病原生物中将是该酶利用的有力方式，值得生防工作者尝试。例如某些昆虫病原线虫品种培养方便、生长繁殖迅速，但侵染能力较弱，就可以将烯醇化酶转入这些线虫中，以期获得高毒力、易生产的线虫品系，最终形成廉价高效的生防产品。随着社会对食品安全的要求逐渐提高，生物防治的重要性也越来越突出，改进现有生防因子的效果显得更为迫切。烯醇化酶作为一种广谱性的促进病原生物侵染的蛋白，具有较高的应用潜力，如果能通过转基因技术来提高生防因子的毒力，将会对生物防治研究和发展起到重要的推动作用。

主要参考资料

[1] 神经元特异性烯醇化酶的临床应用研究进展

[2] 烯醇化酶在病原生物侵染寄主中的作用