文献解析|α-溶血素通过ADAM10-Notch信号调控树突状细胞分化增强免疫应答的机制解析

Alpha hemolysin enhances the immune response by modulating dendritic cell differentiation via ADAM10-Notch signaling

一、研究背景与立题依据

金黄色葡萄球菌α-溶血素（Hla）是一种成孔毒素，通过结合宿主细胞表面的ADAM10受体引发细胞毒性，在细菌致病过程中起关键作用。然而，其突变体HlaH35A虽丧失成孔活性，却保留ADAM10结合能力，并被证明可作为疫苗载体蛋白显著增强抗原免疫原性。前期研究表明，HlaH35A与铝佐剂联用能协同提高抗伪中间绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）感染的保护效力，但其免疫调节机制尚未明确。树突状细胞（DCs）作为连接先天与适应性免疫的核心桥梁，其分化状态直接影响疫苗诱导的T细胞应答类型。ADAM10不仅作为Hla的受体，还通过切割Notch受体参与免疫细胞分化调控，但外源性抗原如何通过ADAM10-Notch轴调节DC功能仍是未知领域。

本研究以伪中间绿脓杆菌的新型保护抗原PA0833为模型，构建HlaH35A-PA0833融合蛋白（HPF），系统探讨HlaH35A通过ADAM10-Notch信号调控DC分化的分子机制。通过体内外实验验证HlaH35A对cDC2亚群分化的特异性促进作用，及其对Th17/Tfh细胞应答的驱动效应，为新型疫苗载体设计提供理论依据。

二、实验设计与方法概要

研究采用多层次实验体系验证HlaH35A的免疫调节功能。在蛋白层面，通过AlphaFold-Multimer预测HlaH35A与小鼠/人ADAM10的相互作用模式，并利用荧光共聚焦显微镜验证结合特异性。细胞实验中使用Flt3L诱导的骨髓来源树突状细胞（FI-BMDCs）和GM-CSF/IL-4诱导的单核来源DC（Mo-DCs），分别模拟常规DC（cDCs）和炎症条件下DC亚群。通过RNA-seq转录组分析、流式细胞术检测表面标志物（MHC-II、CD40、CD80/CD86）、ELISA定量细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-23）及Western blot分析Notch通路蛋白活化情况。

动物实验采用BALB/c和C57BL/6小鼠模型，通过肌肉注射HPF或对照抗原进行免疫，后经气管接种伪中间绿脓杆菌PAO1株评估保护效果。关键干预手段包括使用ADAM10抑制剂GI254023X和γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号传导。此外，通过过继转移实验将体外处理的FI-BMDCs注射至受体鼠，明确DC本身在HlaH35A介导免疫保护中的必要性。

三、ADAM10介导HlaH35A增强抗原免疫原性的关键作用

为验证ADAM10在HlaH35A功能中的核心地位，研究首先通过免疫小鼠模型比较HPF与单独PA0833的免疫效果。如图1所示，HPF免疫组血清PA0833特异性IgG滴度较PA0833组显著提升（约3.2倍），而ADAM10抑制剂GI254023X处理使IgG水平回落至基线（图1b）。值得注意的是，HPF选择性增强IgG1亚类（Th2型应答标志），对IgG2a（Th1型）无影响，但ADAM10抑制同时降低两类抗体滴度（图1c），提示ADAM10在不同免疫细胞中功能存在异质性。

在攻毒实验中，HPF免疫小鼠肺部细菌负荷较对照组降低2个数量级（图1d），体重损失恢复更快（图1e），肺组织炎症浸润显著减轻（图1f）。细胞因子检测显示HPF组促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）下降而抗炎因子IL-10上升，ADAM10抑制逆转此趋势（图1g）。致死剂量攻毒时，HPF组存活率达46%，显著高于PA0833组（13%），且保护作用依赖ADAM10（图1h）。这些数据明确ADAM10是HlaH35A增强免疫保护的必要介质。

四、HlaH35A刺激下树突状细胞的转录组学特征

通过RNA-seq分析HPF处理的FI-BMDCs转录谱，主成分分析显示HPF与PA0833处理组基因表达谱显著分离（补充图1a-c）。HPF特异性上调共刺激分子（Cd40、Cd80、Cd86）和炎症因子（Tnf、Il6、Il10）基因表达（图2a-b），提示HlaH35A强化DC成熟状态。KEGG富集分析表明HPF增强模式识别受体（PRR）信号通路和T细胞应答相关通路，尤其是Th17细胞分化途径（图2c）。GO分析进一步证实HPF对DC发育和T细胞激活通路的协同激活作用（图2d）。

值得注意的是，尽管金黄色葡萄球菌毒素可通过NLRP3炎症小体诱导细胞焦亡，但GSEA分析显示HPF并未激活该通路（图2e），表明HlaH35A的免疫增强作用不依赖于炎症小体介导的细胞死亡。这些转录组特征揭示HlaH35A通过调控DC成熟与分化相关基因网络，而非诱发细胞毒性，优化抗原呈递功能。

五、ADAM10-Notch信号轴在DC成熟与分化中的核心作用

机制探讨表明，HlaH35A与ADAM10结合后激活下游Notch信号。Western blot显示HPF处理组Notch1/2胞内段（NICD）切割增加，而Notch3/4无变化（图4a）。qPCR检测到Notch靶基因（Hes1、Hes5、Hey1）表达上调，且此效应被ADAM10抑制逆转（图4b）。值得注意的是，Notch受体mRNA水平未发生改变（图4c），提示HlaH35A通过调控蛋白切割而非转录激活Notch通路。进一步发现FI-BMDCs中Notch2表达量显著高于其他亚型（图4d-e），为Notch2特异性功能奠定基础。

在DC分化层面，HPF通过ADAM10-Notch2信号促进cDC2亚群（CD11b+SIRPα+）扩增，同时抑制cDC1（Xcr1+）分化（图5c）。Notch抑制剂DAPT处理使cDC2比例下降40%，并阻断迁移相关基因Ccr7表达（图5a-b）。表型分析显示HPF诱导的cDC2呈现ESAM+标志（图5g），且分泌Th17极化关键因子IL-23（图5h），此过程依赖ADAM10-Notch2轴。相反，KLF4依赖性cDC2相关基因（Mgl2、Clec10a）表达受抑制（图5f），证实HlaH35A驱动Notch2依赖性cDC2分化程序。

六、HlaH35A调控的T细胞应答与免疫保护效应

通过过继转移实验，将HPF处理的FI-BMDCs注射至受体鼠后，引流淋巴结中IL-17A+ Th17细胞数量增加2.4倍，而IFN-γ+ Th1或IL-4+ Th2细胞无显著变化（图6b）。同时，PD1+CXCR5+ Tfh细胞比例上升（图6d），证实HlaH35A-primed cDCs优先驱动Th17/Tfh应答。此效应依赖ADAM10-Notch信号，因抑制剂处理使Th17/Tfh细胞数量回落至对照组水平。

在保护性免疫层面，过继转移HPF处理的cDCs可使血清PA0833特异性IgG提升3.5倍（图7b），且以IgG1为主导（图7c）。攻毒后肺部细菌负荷降低80%（图7d），肺组织病理损伤减轻（图7f），炎症因子谱改善（图7g）。生存分析显示HPF-cDCs组存活率达40%，显著高于PA0833组（10%）（图7h）。这些数据明确HlaH35A通过调控cDCs分化增强体液免疫与抗感染保护。

七、跨物种验证与临床应用潜力

为验证机制保守性，研究预测HPF与人ADAM10结合模式（pLDDT=73.6，图8a），并在人MoDCs中验证功能。HPF处理使人MoDCs表面MHC-II、CD40、CD86表达上调（图8b-e），TNF-α/IL-6转录水平增加（图8f），Notch靶基因激活（图8g），且这些效应均被ADAM10抑制逆转。表明HlaH35A的免疫调节功能在人类细胞中高度保守，具备临床转化潜力。

讨论部分指出，HlaH35A作为疫苗载体的创新性在于其通过ADAM10-Notch2轴特异性调控cDC2分化，而非传统佐剂的PRR激活模式。这种定向分化促进Th17/Tfh应答，尤其适用于胞外病原体防御。但需关注Notch1在Th2应答中的潜在作用，以及长期安全性问题。未来研究可通过基因敲除模型深入解析Notch亚型功能，并探索与铝佐剂的协同机制。

八、结论与展望

本研究系统阐明HlaH35A通过ADAM10-Notch2信号轴驱动cDC2分化，进而增强Th17/Tfh应答与体液免疫的分子机制。其创新点在于揭示细菌毒素衍生物可作为免疫代谢调节剂，通过靶向宿主蛋白酶受体重塑DC分化程序。HlaH35A不仅为Th17导向疫苗设计提供新载体，更拓展了蛋白疫苗佐剂化策略的维度。未来需在非人灵长类模型中验证安全性与有效性，并探索其在肿瘤疫苗或自身免疫病治疗中的应用潜力。