文献解析|基于Mycobacterium smegmatis的生物安全小鼠骨骼结核模型的建立

Establishment of a biosafe murine model of skeletal tuberculosis using Mycobacterium smegmatis

摘要

本文解析了题为《Establishment of a biosafe murine model of skeletal tuberculosis using Mycobacterium smegmatis》的研究论文，该研究由Jia等人于2026年发表在《Animal Models and Experimental Medicine》期刊上。骨骼结核是一种常见的肺外结核，其慢性病程和骨破坏特性使得动物模型研究面临生物安全限制和高成本挑战。本研究利用非致病性分枝杆菌Mycobacterium smegmatis（M. smegmatis）建立了三种小鼠感染模型（颅骨下注射、胫骨内注射和心内注射），在BSL-1条件下模拟了骨骼结核的病理特征，包括骨溶解、死骨形成、肉芽肿炎症和免疫反应。通过微CT、组织学分析和流式细胞术，研究证实M. smegmatis模型能安全、可重复地复现人类骨骼结核的关键方面，为机制研究和药物开发提供了实用平台。本文将从引言、方法、结果和结论四个方面详细解析该研究的内容与贡献。

1. 引言

骨骼结核是肺外结核的重要表现形式，约占肺外结核病例的15.8%，尤其好发于椎体（称为Pott病）和长骨干骺端。其病理特征包括进行性骨溶解破坏、死骨形成和肉芽肿性炎症，常导致慢性疼痛、病理性骨折和残疾。尽管结核病全球负担沉重（2023年新增病例约1080万例），但骨骼结核的研究受限于动物模型的不足。现有模型多依赖高致病性结核分枝杆菌（如H37Rv），需在BSL-3实验室操作，成本高昂且安全性低；而减毒株（如BCG）或非结核分枝杆菌（如M. marinum）模型则无法充分模拟骨骼结核的慢性进展和全身传播特性。

M. smegmatis作为一种非致病性、快速生长的分枝杆菌，与结核分枝杆菌基因组同源性高（超过2000个同源基因），且可在BSL-1条件下培养，已被广泛用于结核病药物筛选和机制研究。本研究旨在利用M. smegmatis建立一种生物安全的小鼠骨骼结核模型，通过三种感染途径（局部和全身）系统评估其模拟人类骨骼结核病理的能力。研究不仅填补了现有模型的空白，还为在标准实验室环境中开展结核病研究提供了新思路。

2. 材料与方法

本研究采用C57BL/6小鼠（6-8周龄），在伦理批准（AMUWEC20223775）下进行实验。以下从细菌培养、动物模型建立、检测方法等方面解析实验设计。

2.1 细菌培养与鉴定

M. smegmatis（ATCC700084）和对照菌株M. marinum（ATCC BAA-535）在Middlebrook 7H9液体培养基中培养（含0.4%甘油和OADC补充物），37℃、220rpm振荡培养。通过透射电镜（TEM）观察菌株形态，显示M. smegmatis呈典型杆状结构（图S2A）。生长曲线比较表明，M. smegmatis生长速率快于BCG和M. marinum（图S2B），这为其快速实验提供了基础。

2.2 动物模型建立

研究设计了三种感染途径：

颅骨下注射模型：小鼠麻醉后，在冠缝前1mm中线处皮下注射100μL PBS悬浮的M. smegmatis（1×10^7 CFU），对照组注射等量PBS。注射后2周处死小鼠，评估局部骨病变。

胫骨内注射模型：通过胫骨平台前内侧钻孔，注入50μL菌悬液（1×10^7 CFU），对照组注射PBS。分别在2周和4周后处死，分析进行性骨破坏。

心内注射模型：通过左心室注射100μL菌悬液（3×10^7 CFU），模拟血行传播。在2、4和8周后处死，评估全身骨骼病变。

所有操作均在BSL-1条件下进行，术后24小时密切监测动物状态。

2.3 检测与分析方法

微CT分析：使用Bruker SkyScan 1272系统扫描骨样本（分辨率7μm），定量骨矿物质密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）等参数。

组织学处理：骨组织经EDTA脱钙后，进行H&E染色和TRAP染色，ImageJ软件定量分析炎症和破骨细胞活性。

ELISA：检测骨髓灌洗液中IL-6和IL-1β水平，评估炎症反应。

流式细胞术：分析脾脏和骨髓中免疫细胞（中性粒细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞及其IFN-γ+亚群）的动态变化。

统计分析：使用GraphPad Prism 9进行t检验、ANOVA和相关性分析，显著性阈值p<0.05。

3. 结果

本研究通过三种感染模型系统评估了M. smegmatis诱导骨骼结核病理的能力，以下分四部分解析结果。

3.1 建立局部颅骨感染模型

颅骨下注射M. smegmatis后2周，微CT显示感染组小鼠顶骨出现多发性骨缺陷，而对照组无异常。有趣的是，定量分析表明感染组骨密度（BMD）和骨体积分数（BV/TV）反而增加（图1B、1C），这与矢状面视图中明显的死骨形成一致。组织学分析进一步证实了炎症浸润和肉芽肿样结构（图1D、1E），且TRAP染色显示破骨细胞数量显著增加（图1F、1G），表明M. smegmatis感染能引发局部骨溶解和修复并存的反应。