踩过N次坑后总结：磁珠分选得率纯度提升核心（上篇）

目的细胞的纯度与得率，是 “样本制备” 与 “细胞分选” 两大环节紧密衔接、共同作用的结果。

样本制备是分选的 “源头地基”：从组织保存、解离到预分选处理，每一步都为后续分选奠定基础；而细胞分选本身，也需系统兼顾分选前准备、过程操作与分选后处理的全程细节。只有两端同时优化，才能实现高纯度、高得率的稳定结果。本期我们将聚焦样本制备全流程，拆解易被忽略的重要操作细节，助您从源头提升分选效能，攻克实验痛点! （分为上下两篇噢）

样本保存

单细胞悬液制备过程中，样本获取后若无法及时处理或需短途运输，需进行特殊保存处理，否则会影响细胞状态进而直接影响细胞活率，导致后续分选实验的得率和纯度下降。样本保存特殊处理建议如下：

组织样本

组织样本通常指非液体组织来源，可用商品化组织保存液保存，将组织完全浸于保存液中，4℃保存或运输，可保证至少48h内细胞活性无改变，极大降低细胞凋亡或死亡。

重要操作Tips：

（1）根据组织块大小选择对应体积离心管，保证组织与保存液充分接触，避免管体过大导致保存液浪费，过小则组织无法完全浸没，局部细胞易干燥坏死。

（2）组织无需剪切，直接放入保存液中，否则会破坏细胞间连接，增加解离难度。

血液样本

    血液样本可使用含特定抗凝剂如肝素钠（abs47014863）等抗凝管保存，可保证至少24小时内细胞活性与免疫学特性稳定，有效避免细胞死亡及活力下降。

重要操作Tips：

（1）使用抗凝管收集血液样本后应立即轻柔颠倒抗凝管5-8 次，使抗凝剂与血液充分接触，避免剧烈震荡，否则会导致溶血。

（2）不同类型抗凝管保存时间有所不同，需根据实验需求进行选择。如无法在规定时间内完成单细胞悬液制备，可将目标细胞分离出来，使用细胞冻存液程序性降温后进行长期冻存。

（3）血液样本收集完成后，应在室温下直立保存运输，且需及时检测样本质量，避免因样本降解、细胞损伤影响后续分选结果，同时需严格排查微生物污染，防止污染导致实验失败或数据偏差。

制备单细胞悬液

单细胞悬液的质量是细胞分选成败的关键，其制备的核心在于 “避免细胞过度解离” 与 “最大化保留细胞数量”之间的精准平衡。针对不同来源的样本，为您推荐如下解离方案：

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实体组织样本

- 机械法：通过物理作用，如研磨、过滤、吹打，分解质地较软或纤维含量少的组织样本。此方法操作简单、快速，成本低，但易造成组织细胞损伤，细胞分散不完全，解离效果较一般。

- 机械法操作tips：

- 组织样本应在冰浴或4℃解离，研磨缓冲液提前预冷，减少细胞代谢消耗和热损伤。

- 研磨时轻柔按压，不要过多研磨或用针头或细口径吸管强行吹打同一组织样本，反复操作会损伤细胞。

- 应根据目的细胞大小选择合适参数的细胞筛网（30/70/100μm）过滤。

- 酶解法：通过消化酶，如胶原酶、胰蛋白酶等，分解如肿瘤、肝脏、肾脏等纤维含量高或质地坚韧的组织。此方法能保持细胞完整性和活性，可选择酶种类丰富多样，但操作较繁琐，消化时间长且难控制，可能影响细胞抗原表位识别。

- 酶解法操作tips：

- 根据不同组织类型选择合适的酶解方案（见表1）。

- 可扫码查看优宁维专属组织分离指南，帮助您根据目的细胞类型选择适宜的解离酶与浓度。

- 酶液需提前在37℃水浴复温，避免冷酶液直接加入样本导致细胞应激。

- 酶解在 37℃或室温孵育20-30min，每10 min轻柔摇晃离心管，以助组织分散，避免超时消化。

表1不同组织解离方案

3.GentleMACS组织解离系统：基于两种传统方法的融合创新，实现组织解离技术的全面革新。

该系统由组织处理器、组织解离试剂盒、专用耗材组成，处理器可外设加热模块或冷冻模块实现温和细胞或细胞核解离，解离过程高效、自动化、标准化可重复，获得细胞活性高、抗原表位被极大保护，可保障下游实验结果真实可靠。

图1. GentleMACS组织解离系统

GentleMACS组织解离系统操作过程：以肿瘤组织为例

先将预处理的组织样本与适量酶解缓冲液一并放入专用 gentleMACS 组织解离管。然后将解离管置于主机上，通过预设或自定义程序进行自动化解离。程序完成后，取出解离管，即可通过过滤或离心快速获得高质量单细胞悬液。

虽然流程清晰简单易懂，但为确保解离效能，小优总结以下高频问题给大家提前避坑：

Q1. MACS组织解离专用耗材C管与M管分别适用于哪种实验场景？

需注意！gentle MACS组织处理器必须与组织解离管配套使用，避免因使用不兼容的耗材导致仪器损坏、程序错误或样本损失。

Q2. GentleMACS组织解离系统操作过程中是否需要人为干预？         

选好程序启动后，设备即进入全自动流程，无需人工值守与手动干预。该设计可规避不同操作者手法差异与计时误差，能够实现解离结果的高度标准化、可重复性与一致性，大幅提升实验效率与可靠性。

Q3. GentleMACS组织解离系统是否只能提取细胞？

不仅能提取细胞，还可通过搭配Cooler模块与专用耗材（#130-130-533），快速、温和获取细胞核。该系统能在保持细胞核完整性与活性的同时，确保高重复性与标准化流程。

Q4. GentleMACS组织解离系统还有哪些特殊应用?

该系统还可适配心脏或肝脏灌流等特殊前处理。通过特定灌流程序与专用耗材（#130-128-151），实现自动化、可控的器官原位灌流，高效清除血液并均匀分布消化酶，显著提升细胞得率与活性。

Q5. 针对样本罕见，没有专属试剂盒怎么办？

美天旎通用型多组织解离试剂盒，如 Multi Tissue Dissociation Kit 1/2（#130-110-201/ 130-110-203）可提供标准化的替代方案。该试剂盒1型和2型核心区别在于分别适配不同组织类型与酶解策略（见表2）。此外，也可在通用试剂盒基础上，调整酶解时间、温度，或补加特定酶（如透明质酸酶）进行实验条件优化。

表2 Multi Tissue Dissociation Kit 1型/2型核心区别

Q6. 组织上机前是否需要预剪切？

预剪切并非固定步骤，关键取决于组织类型。为确保解离效果一致，避免过度解离或细胞损伤，建议严格按照说明书要求判断是否预先剪切。

Q7. 肿瘤组织如何选用合适的组织处理器操作程序？（以人肿瘤组织解离试剂盒#130-095-929为例）

需判断组织软硬程度，选择对应的研磨程序类型（如图2）。搭配对应组织处理器和组织解离试剂盒提供的研磨程序进行选择。软组织（如黑色素瘤、结肠癌等）优先选温和研磨程序，减少细胞损伤；硬组织（如乳腺癌、胰腺癌、肝癌等）可选用加强研磨程序，保障解离充分。 根据软硬程度选择好适配的程序类型后，也需注意解离仪器不同，对应的操作程序也有所不同，具体如下：

图2 肿瘤组织软硬程度分类

（1）若使用带加热功能的 gentleMACS™ Octo 解离仪器，根据下表选择适宜程序，运行结束后可直接按说明书操作进行下一步。

图3 加热款肿瘤组织研磨程序示例

（2）若使用常规gentleMACS™解离仪或非加热模式的gentleMACS Octo 解离仪，无论肿瘤是柔软、中等硬度还是坚硬型，首先统一运行 gentleMACS 程序 h_tumor_01，按说明书操作步骤处理后，进行第二次程序（如图4）。运行结束后，进行第三次程序处理（如图5）。

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图4 常规款肿瘤组织研磨程序示例1    

图5 常规款肿瘤组织研磨程序示例2  

Q8. 罕见组织样本找不到对应的组织解离程序怎么办？

罕见组织样本没有特定标准化解离程序，可咨询优宁维技术获取推荐方案，也可参考说明书中的通用程序摸索最佳处理方案！

Q9. 没有Gentle MACS组织处理器，可以单独用解离试剂盒吗？

可以，因为美天旎的试剂盒是经过严格筛选与优化配比的优质酶解方案。若解离试剂盒不搭配仪器使用，可参考解离试剂盒说明书中“通道2”程序的运行时间（如图3），自行摸索酶浓度优化实验条件。

图6 说明书“通道2“程序示例

Q10. 单次实验上机样本量是多少？

需根据实际样本量折算，但要严格根据样本量添加解离试剂（如图4），避免因试剂不足影响解离效率。

图7 以肿瘤组织解离试剂盒说明书为例

MACS组织解离热卖产品：

血液样本

如何根据不同需求选择合适的外周血处理方法？

裂红法与密度梯度离心法实验流程及操作tips

1.裂红法： 特异性裂解红细胞，富集有活白细胞，以制备细胞悬液。

- 操作tips：

- 溶血素需4℃保存，现用现配；若操作小鼠或大鼠的血源样本，操作温度建议升至37℃，适当增加孵育时间

- 裂红体积应在全血体积的3-5倍左右，建议裂红3-5 min。避免裂解时间过长损伤细胞抗原表位及细胞状态，时间过短则裂解不充分。

裂红试剂热卖产品：

2.密度梯度离心：使用密度梯度介质，利用细胞密度差异实现分层，富集目标细胞。

- 操作tips：

- 根据样本来源及目标细胞类型，选用对应密度参数的Ficoll分离细胞。且使用前需恢复至室温（18-20℃），以确保最佳分离效果

常用分离细胞Ficoll密度参数如下：

1.077 g/mL：分离人外周血、脐带血及骨髓中单个核细胞

1.073 g/mL：人基质细胞、间充质干细胞（MSC）等低密度细胞

1.084 g/ml：分离大鼠、小鼠血液及骨髓中单个核细胞

- 合适的分离温度应保持在18-20°C。温度过高分离介质密度较低，影响分离效果及细胞活性；温度过低，PBMC无法有效富集于分离胶界面，导致分层模糊、红细胞污染及细胞回收率显著下降。

- 离心过程中，离心机应缓升缓降，避免因离心机震动影响细胞分层

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图8. 密度梯度离心分层示意图 

细胞分离相关产品：

优化细胞悬液质量

我们获得的单细胞悬液可能会有一些细胞团块、细胞碎片、死细胞等影响后续分选过程如干扰磁珠标记、堵塞分选柱，导致细胞分选纯度与得率下降。因此，我们可以选用以下细胞优化试剂提升细胞质量：

1.筛网过滤：使用孔径适宜的细胞筛网对粗提细胞悬液进行过滤，以去除未充分解离的组织团块。(MACS® SmartStrainers70μm#130-098-462或70um细胞筛网#abs7232）

2.碎片去除试剂：利用密度梯度离心的原理快速、有效去除细胞碎片（Debris Removal Solution#130-109-398或细胞分离液#abs9102）

3.死细胞去除：磁珠标记死细胞表面的磷脂酰丝氨酸，通过高强度磁场，将死细胞去除（ Dead Cell Removal Kit #130-090-101）

4.裂红试剂：利用渗透压差，裂解无核红细胞。（Red Blood Cell Lysis Solution (10×)#130-094-183或红细胞裂解液（1×）#abs9101）

注：若您后续进行细胞培养，则不需要裂红；若是磁珠分选或测序，则需要进行裂红和细胞碎片去除

细胞状态评估

经质量优化后的单细胞悬液需评估细胞活性，确保细胞活率＞85%，以保证磁珠标记效率获得理想的分选结果。

1.血球计数板：

图9. 血球计数板示意图

- 用无水乙醇（或 95%）擦拭计数板，晾干，取一张干净盖玻片覆在计数板上

- 滴加适量单细胞悬液，确保无气泡且分布均匀

- 显微镜观察，计数四角方格的细胞，遵循“计上不计下、计左不计右”原则

- 按公式计算浓度与活率：

浓度（cells/mL）=（四大格细胞总数÷4）×稀释倍数×10⁴；

活率（%）=（活细胞数÷总细胞数）×100%

2.细胞计数仪：

图10. 细胞计数仪操作示意图

（1）将单细胞悬液按说明书比例与台盼蓝（abs42028917）染液混合

（2）取10-20μL混合液加至专用计数板 

（3）计数板插入仪器指定卡槽，等待读取细胞浓度、活率及粒径分布等数据

注：若目的细胞比例过高（≥90%），超出磁珠的最大上限量，应重新评估分选的必要性，优先考虑直接使用或选择阴性去除方案。