Annexin V 与 7 - AAD 双标在流式细胞术检测凋亡中的应用实例

发布人：上海优宁维生物科技股份有限公司

发布日期:2025/1/27 10:43:16

细胞凋亡检测中 Annexin V 与 7 - 氨基放线菌素（7 - amino - actinomycin D，7 - AAD）或碘化丙啶（Propidium iodide，PI）双染法的原理

在正常状态下，活细胞的细胞膜完整无损，其中的磷脂酰丝氨酸（PS）作为细胞膜的一个组分，处于细胞膜的内侧。而一旦细胞启动凋亡进程，细胞膜的结构随即发生变化，致使原本位于内侧的 PS 翻转至细胞膜表面，且这一现象在凋亡早期便已发生。鉴于此，可利用对 PS 具有高度亲和力且标记有荧光素的膜连蛋白 V（Annexin V）对早期凋亡细胞进行精准检测。

不过，由于晚期凋亡细胞以及部分坏死细胞同样能够与 Annexin V 相结合，所以有必要引入另一项评判指标，也就是细胞膜的通透性。与正常细胞和早期凋亡细胞相比，晚期凋亡及坏死细胞的膜通透性显著增加。如此一来，某些在正常情况下无法进入细胞内部的核酸染料，例如 7 - AAD 和 PI，便能够顺利进入细胞内与 DNA 相结合。

综上所述，借助 Annexin V 和 7 - AAD/PI 双染的检测手段，就能够有效地将早期凋亡细胞与晚期凋亡及坏死细胞清晰地区分开来，从而为细胞凋亡状态的准确判定提供有力依据。

Annexin V和7-AAD双标测凋亡流式染色实例

小鼠腹腔巨噬细胞（数量为每样 2 - 5×105 个）Annexin V 与 7 - AAD 双染实例剖析（本实验中巨噬细胞凋亡由紫外线 30 分钟照射诱导）

一、标志物特征
活细胞呈现 Annexin V - 7 - AAD - ；早期凋亡细胞为 Annexin V + 7 - AAD - ；晚期凋亡及坏死细胞表现为 Annexin V + 7 - AAD + ；特定坏死细胞则是 Annexin V - 7 - AAD + 。

二、流式细胞仪型号
采用 BD FACSCalibur 流式细胞仪进行检测。

三、流式抗体及用量详情
使用 1×Binding Buffer（每测试 250ul，联科生物的 5×Binding Buffer 用 ddH2O 配制，货号：LK - AP101 - 100 - BB）；Annexin V - APC（每测试 1ul，货号：BMS306APC，eBioscience）；7 - AAD（每测试 5ul，货号：559925，BD）。

四、染色条件说明
本实例运用胰酶消化细胞后进行染色操作，且未对细胞表面分子染色。若需标记表面分子，切不可使用胰酶，应先按常规染法标记表面分子，洗净多余抗体后，用 1×Binding Buffer 重悬细胞，再加入 Annexin V 和 7 - AAD，于室温避光孵育 15 分钟。因该法中细胞未固定，染色后需尽快开展检测工作。

五、分析软件信息
运用 Cell Quest 软件进行数据分析。

六、圈门策略与染色情况
FSC/SSC 圈门策略依不同细胞类型而定（本实例见上图）。

七、常见问题及提示
A. 鉴于细胞凋亡受细胞种类、体内外环境、外界刺激以及染色操作等多种因素影响而存在显著差异，利用 Annexin V 和 7 - AAD 双染检测凋亡时，需依据各自实验情形开展多次实验，以精准把握特定实验条件下细胞凋亡的规律与特征。
B. Annexin V 染色具有特殊表现，未凋亡细胞（Annexin V - 7 - AAD - 细胞）经染色后在流式图上位置会向右偏移。经与众多从事凋亡研究的同行交流得知，此为 Annexin V 染色特有的现象，无需诧异。曾尝试通过洗净多余抗体将活细胞群（Annexin V - 7 - AAD - 细胞群）调整至常规认知的 “阴性细胞” 位置，但从实例图可看出该方法无效。至于洗净多余抗体无法解决 “移位” 问题的原因，目前尚不明晰，仅建议不要采用此方法调整细胞在图中的位置，因为清洗后各群细胞比例会发生改变。
C. 因实验中细胞获取不易，本实例采用细胞数量较少。若实验细胞数量充足达 106 级别，可采用 300ul - 500ul 体系，添加 2ul - 5ul Annexin V 和 10ul 7 - AAD，具体染色条件可通过滴度实验自行确定。
D. 使用 Annexin V 和 PI 试剂盒的人员可依照试剂盒说明书进行染色操作。
E. 该方法上机检测过程与一般分子上机检测相似，无特殊之处，无需过度担忧。使用 PI 的人员需注意，PI 发射谱较宽，可选用第二或第三通道检测，任选其一即可。同时，在进行 FSC/SSC 圈门时，所选细胞范围对结果影响较大，分析时应将所有分析对象纳入 FSC/SSC 门内，以确保结果真实可靠。
F. 本法优势在于无需固定细胞且染色快速，但存在不足，当细胞膜破裂时 Annexin V 也可与细胞结合，并且在部分自噬受损细胞中，PS 外翻可能受阻，此时 Annexin V 不适用于早期凋亡检测。