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胺类、酰胺、氨基甲酸酯、尿素及胍类化合物与亚硝酸盐或其他含氮试剂（如N₂O₃和N₂O₄）反应生成会生成亚硝基化合物。

国际癌症研究机构(IARC)根据大量研究数据，将多种亚硝基化合物列为2A类或2B类致癌物（即可能或潜在的致癌物）。国际协调委员会(ICH)M7指南也将其列为“关注物质群”。

图1：常见亚硝基化合物种类及结构特征

近年来，亚硝基化合物（尤其是亚硝胺）引起了全球制药工业及监管机构的高度关注。这一现象的起因是血管紧张素II受体拮抗剂（ARB类药物，如缬沙坦、氯沙坦、厄贝沙坦和奥美沙坦）中检测出微量的N-亚硝基二甲胺(NDMA)。2019年，二甲双胍和雷尼替丁中也检测出了NDMA。自此，因检测到其他类型亚硝胺杂质而导致的药品召回事件屡见不鲜，例如利福平、利福喷丁、伐尼克兰、喹那普利和氢氯噻嗪等药物。全球各地的监管机构发布了多项指南文件和建议，以应对药品中亚硝胺杂质的风险。

值得注意的是由于实际工作中由于亚硝胺(Nitrosamines)的数量远远大于亚硝酰胺(Nitrosamides)，所以导致很多时候“亚硝胺”和“亚硝酰胺”这两类化合物之间的界限被模糊化，导致研发人员在风险评估中错误地将亚硝酰胺等同于亚硝胺，并采用错误的研究方法。但是如果仔细研读官方文件就可以发现，在监管指南中往往会使用更为准确的词汇Nitros-来表示“亚硝基类”化合物风险。

从有机化学角度而言，亚硝酰胺（如酰胺、N-烷基尿素、胍类或氨基甲酸酯的亚硝基衍生物）与胺类的亚硝基衍生物（即亚硝胺）在结构和性质上截然不同。亚硝酰胺的化学反应活性较高，可直接与亲核底物和自由基等物质发生作用，无需通过代谢活化即可表现出诱变性或致癌性。但是大部分的亚硝酰胺由于化学反应活性很高，即使产生也会很快降解成为其他杂质甚至无法分离；然而作为对比，亚硝胺化学稳定性良好，未经代谢的亚硝胺不易于生物分子或其他化学分子发生相互作用，将会在药物中稳定存在，直至经由代谢活化才能发挥作用。因此，这两类化合物不应被混为一谈(Pharmaceutical Technology, Trends in Formulation, 2022 eBook, 42–50.)。 

亚硝胺和亚硝酰胺是亚硝基化合物主要两类结构。亚硝胺由次级或三级胺与亚硝酸盐或其他亚硝基化试剂反应生成，其化学结构可被视为亚硝酸的“胺类衍生物”。其代谢主要依赖于细胞色素P450催化的α-羟基化作用，产生带正电的电亲化物，从而对DNA进行烷基化损伤（图2）。因此，在体外环境中亚硝胺通常较为稳定，广泛存在于环境和药品中，亚硝胺的致癌性需要通过代谢活化后才能体现。

   图2：亚硝胺和亚硝酰胺等亚硝基化合物可诱变化合物代谢途径

相比之下，亚硝酰胺（如N-亚硝酰胺、N-亚硝基氨基甲酸酯、N-亚硝基尿素和N-亚硝基胍类化合物）在化学结构及活化机制上与亚硝胺显著不同。亚硝酰胺的结构中，亚硝基(-NO)与羰基(C=O或C=N)的协同作用，使其无需代谢活化即可直接生成电亲化物。这种直接作用模式，使亚硝酰胺具有比亚硝胺更高的诱变性，但同时也带来了显著的化学不稳定性。

虽然我们可以看到一些亚硝酰胺化合物（如卡莫司汀和洛莫司汀）表现出抗癌潜力，并被用作抗肿瘤药物的活性成分，但对于大部分的亚硝酰胺在药品生产或储存条件下下稳定性较差，会和水分子等亲核试剂发生快速的降解（图3，ACS Symposium Series, 1993, 553 , 1-18.）。

图3：亚硝酰胺和水分子的反应

亚硝酰胺即使在未加任何外源性试剂条件下自身也有可能发生快速的分解反应。参考Julius Rebek Jr.和Fahmi Himo 等研究人员结果（参考文献：Tetr Lett 2011, 52, 2100-2103; J. Org. Chem. 2019, 84, 7354-7361）显示N-丁基-4-甲基-N-亚硝基苯甲酰胺在35℃条件下该亚硝酰胺化合物会在一天内大量分解，直至67小时后完全分解为对应酯基化合物。如果是一级酰胺的亚硝基衍生物甚至会得到降解为对应羧酸的产物(J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 14115–14126.)。实验表明，该降解路径在常见储存条件下广泛存在，凸显了亚硝酰胺的不稳定性。

图4：N-丁基-4-甲基-N-亚硝基苯甲酰胺自身降解反应监测

此外受到环境中光照或酸碱等影响也可能发生其他降解反应(Can. J. Chem. 1969, 47, 2441–2448)，例如在光照条件下亚硝酰胺可能很快发生分解产生酰胺或重排产物，该反应在室温条件下可在数小时内完成，类似的降解反应也会发生在亚硝基磺酰胺结构中(Recl. Trav. Chim. Pays‐Bas 1971, 90, 901–905.)。

图5：亚硝酰胺分解产物

这些降解反应可以参考以下反应机理。

图6：亚硝酰胺自身降解反应机理

鉴于亚硝胺与亚硝酰胺在活化机制、稳定性及毒理效应方面的显著差异，两者不应在风险评估中被等同对待。大部分情况下即使有产生亚硝酰胺杂质的风险，但是对应的亚硝酰胺在物料中往往无法稳定存在，会在极短的时间内降解为其他杂质。因此对于亚硝酰胺的风险评估，首先应考虑该原料药或相关物质的亚硝酰胺杂质是否在物料中稳定存在，然后再选择合理的方法进行定性定量测试。

同时我们也应注意到，越来越多的各国监管机构在指导文件中也开始明确区分亚硝胺和亚硝酰胺的风险，以避免在评估或监管中出现混淆。