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镍柱

亲和层析技术的基本原理在于，它依赖于分子间独特的、高度特异性的相互作用，这些相互作用使得分子间能够形成既专一又可逆的结合，这种力量我们称之为亲和力。

在生物科学中，存在多种具有专一性亲和力的生物分子对，例如：

酶与基质类似物、抑制剂或辅酶之间；

抗体与抗原、病毒或细胞之间；

细胞与其表面的特异蛋白、外源凝集素之间；

核酸与互补碱基序列、组蛋白或核酸聚合酶之间；

激素或药物与受体、载体蛋白之间；

外源凝集素与多糖、糖蛋白、细胞表面受体或细胞之间。

在亲和层析过程中，那些能够与待分离物质特异性结合的分子被固定在色谱基质上，这些被固定的分子被称为配体。配体与基质之间通过共价键紧密相连，共同构成了亲和层析的固定相，也被称为亲和吸附剂。为了构建这种亲和吸附剂，配体首先需要通过共价键与经过活化的基质相结合，从而形成固相载体。常用的载体材料包括琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶以及纤维素等，它们为亲和层析提供了稳定且高效的分离平台。

咪唑环，作为一种五元杂环化合物，其结构特点是含有一个1,3-二氮杂环，英文表述为Imidazole。若从咪唑环上位于第一位或第三位的氮原子上移除与之直接相连的氢原子，所得的部分则被称作咪唑基团。简而言之，咪唑基团是咪唑分子中去除一个与氮原子直接相连的氢原子后剩余的结构片段。

组氨酸的特性在于其轻微的疏水性以及咪唑环所赋予的微弱电性。

多种过渡金属离子，如Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺等，能与N、S、O等供电子原子形成配位键，进而与蛋白质表面的特定基团如组氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巯基以及色氨酸（Trp）的吲哚基发生强烈的亲和性结合，其中咪唑基与金属离子的结合尤为牢固。这些金属离子与咪唑基的结合力按照Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺的顺序递减。

镍离子具有六个潜在的螯合位点。在镍柱的应用中，根据螯合位点的不同，镍柱被分为Ni-NTA和Ni-IDA两种类型。Ni-NTA螯合了四个位点，留下两个空位；而Ni-IDA则螯合了三个位点，剩余三个空位。因此，Ni-IDA Agarose的结合能力相对更强，能够在相同条件下承载更多的蛋白质，但需要使用更高浓度的咪唑来洗脱杂质和目标蛋白。然而，Ni-NTA在稳定性方面表现出优势，更能耐受强还原剂的作用，镍离子不易脱落。因此，在选择镍柱时，需要根据具体的纯化条件进行权衡，以达到最佳的纯化效果。

基质特性概述：

基质是一种具有多孔网状结构的不溶性材料，其渗透性能优异。它具备高度的物理和化学稳定性，能够承受较大的机械应力，从而确保较长的使用寿命。此外，基质还能有效抵抗微生物和酶的侵蚀，保持其结构的完整性。理想的基质应具有均匀的球形粒子，以提高分离效率。同时，基质应具有亲水性，避免非特异性吸附，且含有可活化的反应基团，便于亲和配体的固定。

琼脂糖凝胶微球实例：

琼脂糖凝胶微球，商品名为Sepharose，根据其含糖浓度的不同，分为2B、4B和6B三种类型。其中，Sepharose 4B的结构相对疏松，吸附容量适中，因此在实际应用中最为广泛。

配基的选择原则：

配基是一种能够可逆结合特定分子或基团的分子，是亲和色谱纯化的关键。选择配基时，需考虑其特异性和可逆性，确保与目标物能够稳定结合并易于分离。同时，配基应具有化学修饰基团，便于吸附在基质上，且不影响其活性。

间隔臂的作用与选择：

当目标蛋白质的结合位点位于分子内部时，直接偶联配基可能受到空间位阻的影响，导致结合能力降低。此时，可在配基与基质之间插入一个间隔臂，以提高结合效率。间隔臂的长度需适中，过短可能无效，过长则可能导致非特异性结合。一般来说，当偶联的分子量较小时，需要使用间隔臂；而当分子量较大时，则不一定需要。

二硫键在蛋白质结构中的作用：

二硫键是蛋白质中半胱氨酸残基之间形成的共价键，对蛋白质的立体结构起着重要作用。为了确定蛋白质的一级结构，需要打开二硫键，使其变为线状多肽链。

亲和层析的上样与洗脱方式：

上样方式包括直接上样和间接上样两种。洗脱方式则根据配基和目标物的性质而定，包括pH值洗脱、离子强度洗脱和竞争性洗脱（如使用咪唑）。

亲和层析柱的再生步骤：

为了恢复亲和层析柱的性能，需要进行再生处理。具体步骤包括：首先用强变性剂（如6M盐酸胍）冲洗柱子以去除残留的蛋白质；然后用水冲洗干净；接着用0.2%SDS冲洗柱子以去除残留的变性剂；再次用水冲洗干净；之后用50%乙醇冲洗柱子以去除SDS；再次用水冲洗干净；然后用含有Tris和EDTA的缓冲液（如100mM EDTA, 50mM Tris, pH 8.0）冲洗柱子以去除金属离子；再次用水冲洗干净；最后用100mM硫酸镍孵育柱子以重新固定镍离子；最后以20%乙醇保存柱子于4℃环境中备用。

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