2024V36 | <亚硝胺构象差异>引起的「液相色谱双峰」该如何解释？

鉴于近期收到多起N-亚硝胺杂质出双峰，客户要求给一个相对专业或者官方的解释，其实在往期文章《分享 | 西他列汀NTTP杂质，你对核磁的疑惑都在这里！》中我们分析了亚硝胺结构在核磁共振波谱中的一些特异表现。上文提到，由于N-N键具有部分双键的性质，当亚硝胺所连接的N原子两侧取代基不同会存在Z/E异构体的能量差异（下图B1-B2构象）。由于NMR是一种快速检测技术可以在毫秒至秒的时间水平上对待测物体进行检测，这样一个快速的时间尺度可以分辨出许多可以快速转化的两个待测物体。

但是核磁共振波谱仪相对高昂的价格，导致该设备的使用并不像高效液相色谱或者气相色谱一样广泛。那么在更为常用的色谱类分析方法中亚硝胺杂质的结果又是怎么样的呢，亚硝胺的不同构象异构体是否会产生不同的色谱响应信号呢？

其实这个答案是肯定的：在某些色谱条件下亚硝胺两个构象转化速度会降低，即使高纯度的亚硝胺样品也会在色谱上跑成两个峰。

图1：亚硝胺构象差异示例

在QCS标准物质研发中心生产的数百个亚硝胺杂质中，显示了液相色谱双峰的结果。这些分子的不同构相异构体差异比较明显，构象转化所需时间较长，不同构象异构体可以在HPLC中得到很好的分离，液相结果显现双峰。通过LC-MS串联，对两个液相色谱峰信号进行质谱鉴定，发现两个峰的质谱结果完全一致。

例如依那普利拉(Enalaprilat)是一个分子内具有二级胺结构的的药物，该药物的亚硝胺杂质会在色谱中跑出两个峰。本文将以该产品为例，分享亚硝胺构象异构体在液相色谱中的结果。

我中心完成依那普利拉亚硝胺杂质的定向合成后，发现该产品在某些色谱条件下可以走出明显的双峰（图2，保留时间分别为17min和20min），并对双峰进行质谱鉴定，确认其组成一致（图3）。最后结合核磁共振波谱数据（图4），可以确认该样品仅含有那普利拉亚硝胺结构，样品纯度很高。通过分析可以发现：分子内二级胺两侧结构差异较大，亚硝胺syn/anti(B1/B2)构象异构体能量差异较大并且转化速率低，因此不同构象异构体在该色谱条件下可以被有效分离产生双峰，其数据如下图所示（但是需要注意的是，这两个峰依旧是同一个化合物，两个峰会相互转化，参见核磁结果图4）。

   图2：依那普利拉亚硝胺杂质液相色谱结果

图3：依那普利拉亚硝胺杂质质谱结果

图4：依那普利拉亚硝胺杂质核磁共振氢谱结果

通过文献调研，我们发现亚硝胺在色谱研究中双峰是一个常见的现象，有多份研究论文和官方机构文件均有提及该问题。例如：1996年法国F. Berthou 等人发表的研究（Journal of Chromatography A 1996, 727 (1), 83，图5）显示在优化的色谱条件下非对称的亚硝胺杂质可以得到分离，由原来的单峰变成双峰；并且在美国药典《USP通则1469 亚硝胺杂质》中也明确表示不对称的亚硝胺NMBA、NEIPA在所列条件下有可能表现为双峰（图6）。

图5：液相色谱分离亚硝胺不同构象的案例文献

图6：美国药典《USP通则1469 亚硝胺杂质》

最后是我中心的一些亚硝胺案例的数据列表，这些样品均可在特定条件下产生液相双峰，色谱结果均经过确认可放心使用（下文仅摘取部分案例，如需详细数据请联系对应销售人员）。

关于核磁共振(NMR)与液相色谱(HPLC)在化学分析中各有不同的侧重点，对于亚硝胺纯品而言两个方法的测量原理和维度各有差异。将两个测量技术的典型差异简要总结如下表以供参考。