连接酶

连接酶（Ligase），或称连结酶和结合酶。是一种催化两种大型分子, 以一种新的化学键结合一起的酶，一般会涉及水解其中一个分子的团，又称合成酶。能催化两个分子连接成一个分子或把一个分子的首尾相连接的酶。此反应与ATP的分解反应相偶联，在把两分子相连接的同时，发生三磷酸腺苷（ATP)的高能磷酸键的断裂，如DNA连接酶等。连接酶是酶分类中重要的一类 (EC 6): 6.1形成C-O键；6.2形成C-S键；6.3形成C-N键；6.4 形成C-C键。连接酶通常是包括“连接酶”这个字，就如DNA连接酶是将脱氧核糖核酸（DNA）片段连接。其他普遍的名称包括“合成酶”，因为这些酶是用作合成新的分子，或当它们是将二氧化碳加入一个分子时则称为“羧化酶”。 DNA连接酶有两类，一类以NAD为辅基，主要来源于细菌，代表是E. coli连接酶，常规反应条件下能连接切口（Nick）、粘性（Cohensive）末端双链 DNA。 另一类以 ATP 为辅基，来源于病毒、噬菌体、真核生物DNA，代表是T4Lig，能连接切口、粘性末端双链DNA，常规反应条件下能够连接平端（Blunt）DNA。在 各 种 形 式 的 蛋 白 质 翻 译 后 修 饰Post-translational Modifications，PTM) 过程中，泛素化过程近年来引起了越来越广泛的关注，与蛋白质磷酸化信号传导作用相似，泛素化在细胞生命活动的许多进程中，发挥着至关重要的作用。2004年诺贝尔化学奖授予了在“泛素介导的蛋白质降解过程研究”中，做出开创性贡献的三位科学家。泛素是一个由76个氨基酸残基，组成的高度保守的多肽，因其广泛分布于各类细胞中而得名，被泛素标记的蛋白质将被特异性地识别并被迅速降解。
泛素酶复合体三维结构图

目前 DNA 连接反应机理是基于切口双链 DNA 底物得到的：普遍认为连接反应由三步完成：①T4Lig先由ATP供能产生E-AMP复合物；②E-AMP复合物识别双链DNA切口位置，将AMP转移到5’-P基团，形成 5’-P -AMP 复合物；③3’-OH 亲核攻击 5’-P-AMP 形成磷酸二酯键，并释放出AMP。在 PDB 数 据 库（October 2015Release）检测不到 T4Lig 的晶体结构，导致连接机理不完全明了，特别是平端 DNA 连接机理不完善。以热稳定性 Pfu DNA 连接酶晶体结构为模板，笔者通过同源分子建模模拟 T4Lig 结构。 显示出DNA连接酶有三个保守性结构域，DNA 结 合 结 构 域 DBD（DNA- binding domain，M1~ L129），腺 苷 酰 化 结 构 域 Ad D（Adenylaition domain，I130~E368），寡核苷酸链结合结构域OBD（Oligonucleotide-binding-fold，V369~E482）. 腺苷酰化结构域Ad D中 K159 是腺苷酰化位点，通过该位点形成 N6-AMP-lysine 酶-底物复合物。

T4 DNA连接酶原理图

虽然 T4Lig 作为 DNA 连接的工具酶，使用了近 60 年，但是因为由公司提供、同时又是广泛使用，科研人员对其性质了解还不全面，特别是平端 DNA 连接机理。通过综述 T4Lig 的酶分子大小、保真性、切口DNA 连接机理、连接端口检测、酶分子性质理性改造等方面的研究进展，全面了解它的性质、结构、功能，以期达到快速高效体外 DNA 连接，同时总结了几个有待解决的问题，以期对 T4Lig 有更深入、更全面的研究理论。随着越来越多的新型泛素连接酶的发现，更多的三维结构信息和功能研究成果的不断积累，我们对这类具有重要功能的酶家族会有进一步更深入的认识。 [1] 贺添艳,刘亚娟,徐文选,刘猛,刘亮伟. T4 DNA连接酶性质及其平端连接功能[J]. 河南科学,2016,(07):1058-1062. 
[2] 杨娜,侯巧明,南洁,苏晓东. 泛素连接酶的结构与功能研究进展[J]. 生物化学与生物物理进展,2008,(01):14-20. 
[3] 杨东叶,刘凯于,余泽华. 泛素连接酶E3[J]. 细胞生物学杂志,2005,(03):281-285. 
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