蛋白酶抑制剂

蛋白酶抑制剂是指能抑制蛋白水解酶的活性而发挥抗休克作用的药物。蛋白水解是休克的一个重要病理现象，也是休克过程中细胞广泛损伤的一个可能机理，并与休克致死有关。据此提出蛋白酶抑制剂用于防治休克的发生和发展可能有益。目前研究最多的为抗蛋白肽(aprotinin)。该药对休克起保护作用的可能机理为：
①防止激肽释放；
②抑制影响毛细血管内皮完整性的酶的活性；
③防止局部水肿；
④抑制溶酶体酶的释放及作用；
⑤防止心肌抑制因子(MDF)的形成。
临床上要证实上述作用具有一定困难，疗效亦未十分肯定，还有待做大量的研究。 植物蛋白酶抑制剂是广泛存在于植物组织中的一种多肽物质, 对许多昆虫有防卫作用。该基因及其编码区域较小、没有内含子。研究表明, 这些蛋白酶抑制剂在植物对危害昆虫以及病原体侵染的夭然防御系统中担当着重要角色。昆虫饲喂实验发现, 某些纯化的蛋白酶抑制剂具有明显的抗虫作用。利用蛋白酶抑制剂基因来提高植物的抗虫能力, 已成为植物基因工程研究的一个热门领域。在植物中发现有三类蛋白酶抑制剂: 丝氨酸蛋白酶抑制剂, 琉基蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中对丝氨酸类蛋白酶抑制剂的研究最为透彻, 目前在植物中至少已经发现有6个家族, 其中的弧豆胰蛋白酶抑制剂, 马铃薯蛋白酶抑制剂兀的抗虫效果最为理想。蛋白酶抑制剂的杀虫机理蛋白酶抑制剂杀虫的机理在于: 它能与昆虫消化道内的蛋白消化酶相互作用形成酶抑制剂复合物(El)阻断或减弱消化酶的蛋白水解作用。所以, 一旦昆虫摄食进蛋白酶抑制剂, 就会影响外来蛋白的正常消化, 同时, 蛋白酶抑制剂和消化酶形成El复合物, 能刺激消化酶的过量分泌, 通过神经系统的反馈, 使昆虫产生厌食反应。由于蛋白酶抑制剂抑制了昆虫的进食及消化过程, 不可避免地将导致昆虫缺乏代谢中必需的氨基酸, 最终造成昆虫的非正常发育或死亡。 胰蛋白酶抑制剂是大豆籽粒中含有的一种营养阻抗因子，是毒性蛋白质，能抑制蛋白酶的活性，使大豆蛋白质不能分解成人体(或动物) 所需的各种氨基酸。 蛋白酶体是一个多亚基的大分子复合物，广泛分布于真核细胞的细胞质和细胞核中，是具有多种催化功能的蛋白酶复合物，参与细胞内大多数蛋白的降解。
蛋白酶体抑制剂可阻止肿瘤生长、播散和血管形成，并通过阻止NF-κB的激活而诱导凋亡。
Bortezomib(PS341)是一种二肽硼酸类蛋白酶体抑制剂，可在多种肿瘤细胞株和其他癌变细胞中诱导凋亡，可显著增强依立替康、吉西他滨、阿霉素等化疗药物和离子化放疗等方法诱导肿瘤细胞凋亡的疗效，对蛋白酶体的抑制作用是可逆的。
乳胞素(Lactacystin)是一种选择性的20S蛋白酶体抑制剂，是链霉菌属的天然代谢物，为不可逆地与蛋白酶体结合从而抑制蛋白酶体的活性。
MG132是一种可逆的醛基肽类蛋白酶体抑制剂，可抑制26S蛋白酶体的活性，可使细胞周期停滞于G2-M期，以剂量依赖的方式抑制增殖和诱导凋亡。 基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)通过在MMP酶原活化阶段与MMP形成稳定的复合物，抑制其自我活化或在MMP活化之后与MMP等比例结合而抑制其活性。
TIMP对肿瘤生长和血管生成的调控作用十分复杂，其对肿瘤和血管发挥何种作用取决于TIMP在肿瘤微环境中的浓度、作用于肿瘤细胞的时间和肿瘤细胞表面是否存在TIMP受体。
在多种肿瘤模型中TIMP都显示出抑制血管生存、肿瘤生长和转移的活性；但在某些情况下，TIMP具有促进肿瘤生长和肿瘤血管生成活性，如在乳腺癌细胞株中过量表达TIMP-1，后者反而增强VEGF表达，促进血管生成和肿瘤生长。
TIMP的作用方式有依赖于或不依赖于MMP方式的两种，即通过调控MMP的活性发挥作用或与细胞表面的未知受体结合而引发信号转导通路的改变。 半胱氨酸蛋白酶抑制剂是能抑制半胱氨酸内肽酶的蛋白质。可分为三型：Ⅰ型为胞内型100个氨基酸残基的单链蛋白质，不含二硫键及糖链；Ⅱ型为外泌型，约含115个氨基酸残基和两个二硫键；Ⅲ型为多结构域蛋白质，哺乳动物的激肽原属于此类。此外尚有未分型的类半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
有关蛋白酶抑制剂的作用机制，分类，常用的蛋白酶抑制剂，蛋白酶体抑制剂，植物蛋白酶抑制剂等信息由Chemicalbook的晓楠编辑。 丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor，Serpin)超家族是由一系列具有同源性的蛋白质组成的蛋白质家族，其中有PEDF、maspin、kallistain、血管紧张素原、抗凝血酶等。
1999年，Dawson等发现PEDF是一种内源性的血管生成抑制剂，现认为PEDF是目前发现的活性最强的内源性血管生成抑制因子，PEDF主要通过特异性诱导激活的内皮细胞凋亡发挥血管生成抑制作用。
2002年，Miao等的研究证实kallistain是一种内源性的血管生成抑制因子，可抑制VEGF、bFGF诱导的内皮细胞增殖和迁移。kallistain含有一个肝素结合结构域，与HSPG结合，与VEGF-A165、bFGF等肝素依赖生长因子竞争性结合受体，阻断VEGF-A165、bFGF所诱导的信号转导;并可通过抑制血管舒缓素的活性阻滞MMP-2、MMP-9的激活。 钙蛋白酶抑制蛋白(calpastain)是一种依赖Ca2+ 的、有高度特异性的内源性钙蛋白酶抑制剂，在内质网中，钙蛋白酶的催化亚基和调节亚基与钙蛋白酶抑制蛋白发生相互作用。钙蛋白酶抑制蛋白基因包含有至少4个不同的启动子，其mRNA存在广泛的选择剪接，因此其单个基因易引起不同的钙蛋白酶抑制蛋白异构体。这些不同的异构体在相同的组织中均被观察到。钙蛋白酶抑制蛋白与钙蛋白酶的结合、钙蛋白酶受抑制、钙蛋白酶从钙蛋白酶抑制蛋白的分离以及钙蛋白酶的激活均依赖于Ca2+的存在。最近此理论受到质疑，因为有研究在无钙条件下发现钙蛋白酶与钙蛋白酶抑制蛋白存在联系。
钙蛋白酶抑制蛋白由N末端的L区和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ区构成。L区是Ca 通道调节区，Ⅰ～Ⅳ区是钙蛋白酶抑制区，其对钙蛋白酶抑制能力为Ⅰ区>Ⅳ区>Ⅲ区>Ⅱ区。不同哺乳动物钙蛋白酶抑制蛋白的cDNAs片段在N末端编码区有显著差别，可被分为四种类型。鼠和牛的钙蛋白酶抑制蛋白(分别是Type Ⅰ和Type Ⅱ)N末端与兔、 猪及人(Type Ⅲ)相比有较长的L区序列。还有一种是从Ⅱ区一部分开始有一个不同的N末端序列(Type Ⅳ)。Type Ⅰ和TypeⅢ mRNA在肝脏中表达较低;Type Ⅱ mRNA在心脏和骨骼肌中表达水平较高，而在肝脏、脑和睾丸中表达却较低；Type Ⅳ mRNA则在睾丸中特异性表达。 罗氏蛋白酶抑制剂cocktail是由罗氏制药开发的一种蛋白酶抑制剂混合片剂，用于在哺乳动物、细菌、酵母或植物细胞的细胞裂解过程中抑制蛋白酶作用。每片可应用于10 ml提取溶液的蛋白酶抑制。
【作用机制】
在细胞裂解和纯化过程中，靶蛋白可能会被细胞中天然存在的蛋白酶分解。综合了7种强大的蛋白酶抑制剂组分，不含EDTA的cOmplete ULTRA迷你片剂可有效抑制各种蛋白酶，保护靶蛋白全长序列和维持完整的结构。该片剂不含EDTA，能让对金属有依赖的蛋白保持稳定，功能不受影响。
而另一种规格的cOmplete ULTRA迷你片剂，则含有8种组分，包含了EDTA对金属蛋白酶的抑制作用。cOmplete ULTRA迷你片剂（EDTA-free）针对源自酵母、大肠杆菌和多种哺乳动物细胞系（如HEK-293和CHO）的裂解液进行了优化，能在各种细胞类型的裂解液中保护蛋白，不受到所有这些裂解液中的丝氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶的影响。
不含EDTA的cOmplete ULTRA迷你片剂同时含有不可逆和可逆性质的蛋白酶抑制剂。其对金属蛋白酶无抑制作用。
内含物30个独立包装的不含EDTA的cOmplete ULTRA迷你片剂，铝箔泡罩包装。每片可应用于10 ml提取溶液的蛋白酶抑制。 1. 在一些实验中需要保持蛋白质的活性，因而要用温和的条件提蛋白以防止蛋白质的变性，在这种情况下释放出来的各种蛋白酶也不变性，需要添加各种蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)、保持低温来抑制其活性。看看免疫沉淀的实验步骤你会发现除了要加多种蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)以外，在整个实验过程当中都要保持低温。
2. 在一些实验中在强烈的变性条件下提蛋白，比如WB中蛋白质完全变性，蛋白酶也因变性而丧失活性，因此对蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)的要求不高，只要添加PMSF、EDTA、在强烈的变性步骤之前保持低温就可以了，另外就是不要反复冻融样品。
常用的蛋白酶抑制剂有：胰凝乳蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、EDTA（金属蛋白酶抑制剂）、PMSF（丝氨酸蛋白酶的不可逆抑制剂，水溶液中很不稳定，所以要在临用前加）。浓度为：PMSF 0.1mg/ml，Aprotinin 1ug/ml，Leupeptin 1ug/ml （均为工作浓度）。