Neomycin优先和核酶-底物复合物相互作用，并且这种相互作用导致切割率降低，通过稳定复合物的基态和使裂解步骤的过渡状态不稳定来实现。  Neomycin导致反式激活区（TAR）的结构的构象变化，可以通过圆二色光谱被检测。Neomycin充当非竞争性抑制剂，可以结合到的Tat-TAR复合物且增加RNA和肽的解离的速率常数（Koff）。 Neomycin是最有效的氨基糖苷类（沟结合物）,用于稳定DNA的三股螺旋。Neomycin稳定TAT，以及混合基DNA三螺旋，比已知的DNA小沟结合剂（通常破坏三螺旋）和多胺效果更好。Neomycin更好的稳定TAT三螺旋，但也可以稳定CGC（+）三螺旋。 Neomycin浓度和电压依赖性诱导胞质和管腔面的通道的部分抑制作用。Neomycin对管腔内的亲和力比胞质更大：零电压的离解常数(Kb(0)) 分别是210.2 nM和589.7 nM。Neomycin也表现出电压依赖性缓解在电位大于60 mV时的抑制作用。